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做透Octet,發Nature!看看教科書級的實驗設計

閱讀:327        發布時間:2024-3-7

如何評價一篇好文章?創新性和可信性才是關鍵標準,而非所用技術手段的復雜程度。近期,《Nature》發表的一篇文章,僅僅采用了兩種主要技術手段便一氣呵成。今天,就讓陳老師帶大家一探究竟。

人類免疫缺陷病毒(HIV)的感染是導致艾滋病的原因,HIV要實現復制和傳播,需要將遺傳物質傳遞到細胞核內并整合進染色體中。近日,馬克斯-普朗克研究所與麻省理工學院合作發表的一篇《Nature》文章[1],揭示了HIV是如何進入核孔的。研究首先指向了核孔復合物(NPC),它由約30種不同的核孔蛋白(Nup)構建而成,其中包括約10種所謂的FG-Nup,它們將形成屏障的苯丙氨酸-甘氨酸(FG)重復結構域錨定到NPC支架上,呈凝膠狀,被稱為FG相(FG phase)。這種FG相填充在核孔中,通常只允許核轉運蛋白(NTR)通過,然而研究發現,HIV衣殼也可以滑過核孔的FG相

 

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圖1. NTR和HIV通過NPC示意圖

 

這篇發表在《Nature》雜志的文章所用的技術手段非常簡單,主要通過激光共聚焦對核膜與HIV進行共定位,并利用Octet®非標記分子互作分析系統檢測HIV衣殼蛋白CA和核孔蛋白(Nups)之間的分子相互作用。這兩種技術一表型功能,一內在機制,二者相輔相成。特別是Octet®系統的分子互作數據,占據了文章相當的篇幅。

該文中關于Octet®分子互作的實驗設計方案堪稱教科書級別,值得我們一同細細品味:

 

在Octet®實驗方法中,研究者們將來自五種不同Nups(Nup98、62、58、50和358)的八個FG結構域固定在鏈霉親和素傳感器上,將二硫鍵穩定的CA六聚體作為分析物。

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圖2.Octet®實驗方法示意圖

驗證Octet®實驗可行性之1

分析物陽參對照設置

 

importin β超家族的成員是最大的核轉運蛋白(NTR) 類,允許NTR及其貨物復合物以非常高的分配系數進入核膜,所以原則上NTR是與FG Nup結合的理想陽性對照。

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圖3. Octet®結果顯示:分析物importin β可以和含有FG結構域的Nup結合,其親和力類似

驗證Octet®實驗可行性之2

固化物陽性對照和陰性對照設置

 

據文獻報道,CA可以和Nup153和CPSF6結合,所以Nup153和CPSF6可以成為良好的固化物的陽性對照。當然,與無關的固化物陰性對照Nesprin2沒有結合。

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圖4. 左圖:固化物Nup153與分析物CA六聚體的結合

中圖:固化物CPSF6與分析物CA六聚體的結合

右圖:固化物Nesprin2與分析物CA六聚體的結合

可行性確認后,驗證CA六聚體與不同Nups的結合強弱及狀態。

CA六聚體可以與富含FG結構域的不同家族Nups快速動態結合,并且與分析物陽性對照Nup153和CPSF6親和力相似,也與importin β親和力相似。因此,CA六聚體可以廣泛的與FG重復序列的Nups結合。

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圖5. CA六聚體與所有富含FG結構域的Nups結合,并且結合速率較快

結合特異性驗證(分析物陰性對照)

 

Octet®檢測發現FG結構域的Nups與CA-N57A突變(該突變會阻礙與Nup153和CPSF6的FG基序的相互作用)的親和力減弱。

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圖6. 黑色虛線是突變體CA-N57A的親和力,與未突變相比,親和力大大降低。

基于生物層干涉技術的Octet®非標記分子互作系統是這篇《Nature》文章揭示分子機理的關鍵方法。一方面,因為在固化物和分析物上各種對照讓結果更可信外,另一方面還因為Octet®系統具有以下優點:

  • 非標記Direct binding是趨勢,結果更準確

  • 快速測定親和力,更加定量化地表征分子互作

  • 無洗滌步驟,可測弱親和力(解離快);本文的分子互作的解離都比較快,用傳統的pull-down技術可能會被洗掉,導致假陰性結果

  • 寫入了美國藥典,文章多,認可度廣

  • 萬金油技術,可以用與檢測DNA,小分子,蛋白質等各種生物分子

  • 操作簡便,耗材及維護成本低

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只要把Octet®做透,發好文章不是難題!

 

 

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《生物層干涉技術應用文集(第三版)》

《生物層干涉技術小分子應用文集》

《生物層干涉技術病毒研究應用文集》

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-參考文獻-

[1] HIV-1 capsids enter the FG phase of nuclear pores like a transport receptor.Nature,2024

 

 



 

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