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撥開迷霧：熒光定量內參基因
我們在進行qPCR實驗時，對于內參基因的選擇往往會不假思索地選擇GAPDH和β-actin或18S rRNA之類的內參基因。貌似除了這些，我們并沒有別的更好的選擇。即使你對這些基因產生了質疑，無論是查閱參考文獻還是與師兄師姐討論過后，依舊還是義無反顧的選擇之前的選擇。久而久之，GAPDH和β-actin或18S rRNA三位在內參基因界的江湖地位就已經不可動搖了。
大家都知道，內參基因的作用就是去除不同樣本在RNA產量、質量以及逆轉錄效率上可能存在的差別，從而獲得目的基因特異性表達的真正差異。所以，我們會選擇內參基因進行校正和標準化。通常我們選擇內參基因的標準是①高度或中度表達，排除太高或者太低；②表達水平不受任何外源性因素等影響；③不存在假基因。
今天我們來扒一扒上述三個內參基因。
GAPDH
為什么GAPDH被選作內參基因？
GAPDH是甘油醛-3-磷酸脫氫酶的縮寫，經典的糖酵解反應中的一個酶。該酶廣泛存在于眾多生物體中，并且在細胞中含量豐富，占總蛋白的10%-20%。GAPDH基因有高度保守的序列，在同種細胞或者組織中的蛋白表達量一般是恒定的。故長期以來該基因被廣泛用作qPCR或Western blot中的內參基因。
GAPDH不適合選作內參的情況
GAPDH基因是糖酵解中的關鍵基因，正是因為如此，在代謝中過程中的表達很容易受到多種因素的影響。如在細胞的增殖過程中，細胞需要的能量ATP增多，糖酵解代謝加大，GAPDH基因的表達水平很有可能被上調。有報道稱，該基因可作為腫瘤發生的標志物，在腫瘤組織與正常細胞及癌旁正常組織比較時，GAPDH表達并不一致。故在比較腫瘤組織與正常組織或細胞的某種基因或蛋白的表達時，GAPDH作為內參應慎重。
GAPDH基因功能的多樣性
β-actin
為什么β-actin被選作內參基因？
β-actin選作內參基因因其序列高度保守，其mRNA表達數量高，是橫紋肌肌纖維中的一種主要的蛋白成分，也是肌肉細絲及細胞骨架微絲的主要成分。該基因幾乎在所有真核細胞中表達，廣泛存在哺乳動物動物的組織與細胞內。故其作為內參基因是得到*的。
β-actin不適合選作內參的情況
對于actin蛋白由幾種異構體組成，actin大致可以分為6種，存在于組織分布特異性，不同actin之間具有較大的序列相似性(>90%)。在肌肉組織中β-actin分布很少，心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的組織都適合選β-actin作為內參。例如當細胞向惡性轉化時，β-actin mRNA的表達水平增加；而假基因的的存在也可干擾β-actin的檢測，此時并不適合選擇β-actin作為內參。
18S rRNA
18S rRNA與30多種核糖體蛋白共同構成真核生物核糖體40S小亞基，從而與60S大亞基一起完成細胞中的蛋白質合成。
為什么18S rRNA被選作內參基因？
18S rRNA作為內參的原因可總結如下：①18S rRNA存在于核糖體小亞基中，其編碼基因rDNA（18S rRNA/rDNA）在生物演化過程中相當保守；②存在于所有真核生物細胞中； ③易于使用通用引物擴增；④rRNA的合成是由RNA聚合酶I合成，mRNA是由RNA聚合酶II合成，因此rRNA合成的調節獨立于mRNA，在影響mRNA表達的各種條件下，各種rRNA水平很少發生變化；⑤rRNA屬于高峰度表達，遠遠高于目標mRNA，較其他內參基因穩定且受RNA降解影響較小。故18S rRNA被廣泛選作內參。
同樣是rRNA的5S rRNA和5.8S rRNA以及28S rRNA就不適合作為內參，因為①5S與5.8S在核糖體大亞基中的rRNA分子序列短，提供的信息少；②28S rRNA序列雖然較長，可提供更多的信息，能更準確地揭示系統發育的規律，但基因數據庫中相關信息較少，不利于比較分析。
18S rRNA不適合選作內參的情況
然而，rRNA的轉錄易受到各種生物因素和藥物的影響。在有絲分裂期間，28S、18S rRNA明顯減少或停止表達。此外存在很大爭議的是rRNA不包括poly(A)尾，在以oligo(dT)為引物的cDNA合成中不能被逆轉錄，建議在反轉錄的過程中除用oligo(dT)引物外，還要用18S作為反向引物，反轉錄后的cDNA用RNA酶處理一下，再高溫滅活。
其他內參基因的表達情況
其實不僅僅是GAPDH和β-actin或18S rRNA這三個基因在作為內參基因的存在問題，其他的很多內參基因在不同組織中的表達水平也是存在較大差異的。如不同內參基因在不同組織中表達波動較大的HPRT基因△CT為10.3；同一內參基因在不同的組織中，如心，腦，胎盤，肺，肝，骨骼肌，腎等組織中表達也不是恒定的。見下圖：
不同的內參基因在不同組織中△CT變化 |
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結論
沒有一種RNA的表達水平在所有條件下是恒定的，在各種因素的影響下，如細胞周期的不同階段，內參基因的RNA表達水平是變化的。至今，不存在任何一種基因適用于所有類型的細胞或組織。故我們研究者應該根據自己所研究的細胞和組織類型以及實驗要求，做預實驗。從多種內參基因中篩選出適合自己實驗的穩定表達的內參基因。同時也可以選擇多內參基因的研究方法，設置兩個或兩個以上內參基因，取平均值，然后去校正自己的目的基因能夠得到更可靠的結果。
參考文獻
- Radoni? A, Thulke S, Mackay I M, et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2004, 313(4):856.
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- Nicot N, Hausman J F, Hoffmann L, et al. Reference gene selection for RT-qPCRnormalization in potato during biotic and abiotic stress[J]. Journal of Experimental Botany, 2005, 56(421):2907-2914.
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產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） |
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HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (Low Rox Plus) | 11202ES03/08/60 | 1/5/100 ml | 180/498/5980 |
HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus) | 11203ES03/08/60 | 1/5/100 ml | 180/498/5980 |
UNICONTM qPCR SYBR® Green Master Mix ( 抗體法，No Rox) | 11198ES03/08/25/50/60 | 1/5/25/50/100 ml | 196/586/2496/4596/7996 |
UNICONTM qPCR SYBR® Green Master Mix ( 抗體法，Low Rox) | 11199ES03/08/25/50/60 | 1/5/25/50/100 ml | 196/586/2496/4596/7996 |
UNICONTM qPCR SYBR® Green Master Mix ( 抗體法，High Rox) | 11200ES03/08/25/50/60 | 1/5/25/50/100 ml | 196/586/2496/4596/7996 |
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