【Chemical Science】雙功能熒光分子檢測富集5醛基尿嘧啶

*，一卵雙生的雙胞胎也不可能長得一模一樣，那么為什么具有相同的遺傳物質的雙胞胎（DNA序列）卻在實際的生長過程中并非長得全部一樣呢（基因的表達）？表觀遺傳學領域在這個方面有深入的探討。

DNA作為遺傳物質在自然界的影響下會發生堿基修飾、突變甚至是缺失。DNA的甲基化和去甲基化就是生命過程中非常重要的一個環節。在去甲基化的過程中胞嘧啶的修飾物會經歷從正常胞嘧啶（C）到5hmC（5-羥甲基胞嘧）再到5fC（5-甲酰基胞嘧啶），進一步再氧化為5caC（5-羧基胞嘧啶）的過程，而胸腺嘧啶也可以被TET酶氧化成5hmU。研究發現醛基修飾的尿嘧啶（5fU）可能在表觀遺傳學中也會起到一定的作用，例如在引入堿基錯配，改變DNA的結構等。通過化學手段，對生命體的有著特殊修飾的堿基的選擇性識別和富集是極其有必要的。

研究背景

2014年德國慕尼黑大學Thomas Carell教授報道了TET酶可以氧化胸腺嘧啶變成5羥甲基尿嘧啶（Nat. Chem. Biol. 2014, 10, 574），這一結果揭示了胸腺嘧啶（T）的氧化產物（5hmU、5fU、5caU）可能存在著一定的表觀學意義（T的氧化關系見圖1）。2015年劍橋大學Balasubramanian shanker篩選了一系列的生物素化的有機小分子用于5醛基尿嘧啶的富集（J.Am. Chem. Soc., 2015, 137, 9270），并于今年，將其用在針對真核生物的寄生蟲利什曼原蟲（eukaryote parasite Leishmania）的5羥甲基尿嘧啶的全基因組測序（Genome Biol，2017,18，23)）。

圖1 胸腺嘧啶（T）的氧化關系圖

傳統的5fU-DNA鏈的合成主要通過Pt催化-氧化鋨氧化-高碘酸鈉氧化，由于其使用的催化劑劇毒限購，對設備要求高，使得很長時間5fU-DNA合成沒有顯著的突破。2017年武漢大學報道了一個丙二醇保護的5fU固相合成DNA單體，并將其結合到了傳統的DNA固相合成中，實現了對這一技術的突破（Nano Res., 2017, DOI:10.1007/s12274-017-1445-2.）。（圖2）

圖 2

研究思路

近日，學術期刊《Chemical Science》（IF=9.144）發表了武漢大學在這個領域內的成果。該研究團隊設計合成一個生物素化的含有鄰苯二胺結構的萘酰亞胺探針，并將其用于熒光檢測在Hela細胞中經過伽馬射線誘發產生的5fU，以及實現對5fU的選擇性富集。其中小分子的作用機理是通過鄰苯二胺中的氨基富裕的電子發生PET效應，猝滅了萘酰亞胺的熒光。當探針分子高選擇性的與5fU發生共價作用以后，PET效應消失，熒光重新恢復，并且這個探針偶聯有生物素，可以在后期應用于生物素-親合素系統(Biotin-Avidin—System,BAS)，實現對5fU的選擇性富集。（圖3）

圖3 基于PET熒光淬滅效應選擇性富集熒光檢測的生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子

部分簡寫詞語的含義

5fU：5醛基尿嘧啶

5hmU：5羥甲基尿嘧啶

5caU：5羧基尿嘧啶

TET：Ten-eleven translocation，是生物體內存在的一種α-酮戊二酸（α-KG）和2價Fe離子依賴的雙加氧酶。

光致電子轉移(PET)：光致電子轉移是指電子給體或電子受體受光激發后，激發態的電子給體與電子受體之間發生電子轉移從而導致熒光的淬滅過程。具體PET過程如下：在光激發下，具有電子給予能力的鍵合基團能夠將其處于zui高能級的電子轉入激發態下熒光基團空出的電子軌道，使被光激發的電子無法直接躍遷到原基態軌道發射熒光，從而導致熒光的淬滅;當鍵合基團與底物結合后，降低了鍵合基團的給電子能力，抑制了PET過程，熒光基團中被光激發的電子可以直接躍遷回到原基態軌道，從而增強了的熒光基團的熒光發射。因此在未結合底物前，傳感器分子表現為熒光淬滅，一旦鍵合基團與底物相結合，熒光基團就會發射熒光。

生物素-親合素系統(Biotin-Avidin—System,BAS)：生物素－親合素系統（Biotin-Avidin—System,BAS）是70年代末發展起來的一種新型生物反應放大系統。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于醫學各領域。近年大量研究證實：生物素—親合素系統幾乎可與目前研究成功的各種標記物結合。生物素與親和素之間高親合力的牢固結合以及多級放大效應，使BAS免疫標記和有關示蹤分析更加靈敏。它已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術。

研究結果

1、生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子對含有5fU-DNA鏈的選擇性反應

研究人員首先嘗試了含有5fU的人工合成的DNA鏈，通過液相色譜，DNA凝膠電泳，熒光儀器以及聚合酶中止反應證明了探針分子對5醛基尿嘧啶反應的高選擇性（見圖4）。

圖4 生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子選擇性與5fU反應

2、對伽馬射線處理Hela細胞的成像

作者將Hela細胞分成了三組，分別是進行伽馬射線照射，不加化合物；不進行伽馬射線照射，加化合物；以及伽馬射線處理后進行化合物孵育。結果表明，探針分子與經過伽馬射線氧化損傷以后的Hela細胞孵育后可以看到明顯的熒光響應。（見圖5）

圖5 生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子對Hela細胞熒光顯色作用

3、探針分子對5fU富集

研究人員選用了實時定量PCR技術來對富集出來的5fU進行定量，并且使用了上海翊圣生物科技有限公司的Hieff qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox )（貨號：11201ES08）這一優勢產品。使用時，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行實時熒光定量PCR，大大簡化操作過程，縮短操作時間，降低污染幾率。

該產品采用的DNA聚合酶配體可以隨溫度變化，實時調節DNA聚合酶活性。配方添加了可有效抑制非特異性PCR擴增因子與促進PCR反應擴增效率的因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區域內獲得良好的線性關系。線性關系見圖6。