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柱式法質粒提取的原理
柱式法質粒提取主要基于SDS-堿裂解法。細胞在高pH的強陰離子洗滌劑SDS作用下，細胞壁被裂解，染色體DNA和蛋白質發生變性并相互纏繞形成大型復合物。這些復合物在鉀離子取代鈉離子時從溶液中沉淀下來，而質粒DNA則留在上清液中。由于DNA帶負電，質粒提取柱中的硅基質膜在高鹽條件下能選擇性地吸附DNA。通過去離子水洗脫，最終得到純化的質粒DNA。
質粒提取的每種試劑關鍵成分是什么呢？今天我們來大揭秘
組分 | 關鍵成分和功能 |
緩沖液 RS*（P1） | 關鍵成分:25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、50mM 葡萄糖 功能:將菌體沉淀懸浮起來，有助于后續實驗進行。 注:在使用緩沖液 RS*之前，需要添加 RNase A，該酶的作用是降解溶液中的 RNA |
裂解液 LB（P2） | 關鍵成分:250mM NaOH、1%(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉) 功能:細胞進行裂解 |
結合液 BD（P3） | 關鍵成分:3M醋酸鉀（potassium acetate）和5M醋酸 功能:中和NaOH，并清除蛋白質等細胞內雜質 |
漂洗液 W* | 關鍵成分:10mM Tris-HCl(pH7.5)、80%乙醇(Ethanol) 功能:去除DNA提取過程中產生的多余鹽離子 |
洗脫液 | 關鍵成分:10mM Tris-HCl（pH7.5）的溶液 功能:幫助DNA從硅膠柱中洗脫出來 |
質粒提取之后，如何評估質粒DNA的產量和質量呢？
目前使用分光光度法定量質粒DNA和通過瓊脂糖凝膠電泳進行質粒DNA產率和質量的分析是兩種常用的方法。
舉例：提取2 mL過夜培養的大腸桿菌PUC19質粒，分光光度法檢測質粒的得率，在15 μg左右，260/280=1.8~2.0，260/230=2.0~2.3；瓊脂糖凝膠電泳顯示三條帶，從上至下依次為：開環DNA、線性DNA、超螺旋DNA，其中超螺旋DNA的占比＞90%。
質粒提取常見問題案例梳理
出現嚴重的RNA污染
如圖所示，質粒提取之后進行瓊脂糖凝膠電泳，出現明顯的RNA條帶，說明有RNA污染。
原因及解決方法：
（1）未在緩沖液 RS*中事先加入RNase A。解決方法：補加RNase A。
（2）加入RNase A的緩沖液 RS*長期保存于室溫，導致RNase A活性下降。解決方法：每次使用后置于 4℃保存。若長期不用，置于-20℃保存。
（3）細菌過量,RNase A不能有效降解RNA。解決方法：將細菌用量減半或增加RNase A在緩沖液 RS*中的濃度。
出現基因組污染
（1）菌體裂解和中和過程中,劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：溫和地進行菌體的裂解和中和。
（2）加裂解液 LB時操作時間過長，造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：將裂解步驟控制在5分鐘內完成。
（3）細菌的質量差（反復凍融的細菌，陳舊的細菌，培養條件不合適的細菌等）中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA，使用生長良好的新鮮細菌。
超螺旋質粒比例低
如圖右所示，質粒提取之后進行瓊脂糖凝膠電泳，開環質粒的占比約20%，說明超螺旋比例低，一般超螺旋比例需要＞90%，一般來說超螺旋比例越高，質粒的穩定性越高，高超螺旋比例的質粒在轉染效率、基因表達水平等方面具有更好的表現。
原因：裂解時間不宜過長，加入裂解液后裂解時間不應超過5分鐘，以免質粒受到破壞
解決方法：優化裂解時間；確保質粒的結合和所有溶液都在室溫下進行，減少離心力對質粒超螺旋結構的影響，因為過度的離心可能會破壞質粒的超螺旋結構。
內毒素殘留高
常規質粒DNA純化中，質粒DNA仍需要從55%蛋白質、20%RNA、3%內毒素和3%基因組DNA中分離，在質粒DNA制備的菌體裂解過程中，內毒素分子被釋放到溶菌液中。由于內毒素常形成囊狀結構，其分子量、電荷性和疏水性都與質粒DNA相似，常用的純化方法很難將內毒素與質粒DNA分開。內毒素會降低原代細胞和敏感培養細胞的轉染效率，干擾免疫細胞的體外轉染。由于實驗目的不同，對質粒DNA的內毒素要求亦不同，尤其是在細胞轉染、基因沉默研究、基因治療等過程中，對質粒質量、內毒素水平要求更為苛刻，對于非敏感型的的轉染實驗，要求內毒素殘留0.1～2.5 EU/ug，對于敏感型的的轉染實驗，要求內毒素殘留＜0.1 EU/ug。
原因：內毒素去除時操作不當或者未選擇合適的試劑
解決方法：
（1）如果采用的內毒素清除的方法，離心之后，上層水相含DNA，下層藍色油狀相含內毒素和其它雜質。這時注意不要吸到藍色油狀層，里面含內毒素等雜質。
（2）在使用樹脂純化系統去除內毒素時，需要先活化樹脂，然后使用平衡緩沖液平衡樹脂，以確保最佳的去除效率。
翌圣生物的質粒提取試劑盒，歷經市場多年的磨礪與錘煉，產品成熟而穩定。產品品質，不僅贏得了廣泛的認可與贊譽，更累積了超過300的影響因子總分數，成為眾多科研工作者！
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