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細(xì)胞貼壁原理
大部分來自實(shí)體組織器官的細(xì)胞都會(huì)貼壁，但不是所有的細(xì)胞在體外培養(yǎng)的情況下都會(huì)貼壁。許多細(xì)胞必須添加促貼壁物質(zhì)才能貼壁生長(zhǎng)，促貼壁物質(zhì)一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白和膠原蛋白等。
細(xì)胞首先分泌細(xì)胞外基質(zhì)，這種細(xì)胞外基質(zhì)黏附在支持物的表面（如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿的底面）。細(xì)胞通過其表面的黏附因子與這些細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。所以細(xì)胞貼壁與否與細(xì)胞本身分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力以及細(xì)胞本身表達(dá)的黏附分子的數(shù)量有關(guān)，也與培養(yǎng)皿壁的表面結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)基中的黏附蛋白有關(guān)。
是眾多介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱。
是由動(dòng)物細(xì)胞合并分泌到胞外、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子。
二者大多數(shù)均為糖蛋白，因此具有較強(qiáng)的親水性。因此細(xì)胞貼壁與否和細(xì)胞本身分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力以及細(xì)胞本身表達(dá)的黏附分子的數(shù)量有關(guān)，也與有無合適的底物（培養(yǎng)瓶）有關(guān)。大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)和體外均附著于一定的底物而生長(zhǎng)，在體外時(shí)這些底物可以是其他細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。
膠原蛋白（Collagen）
膠原蛋白是支持細(xì)胞和組織生長(zhǎng)的重要胞外基質(zhì)蛋白，其形成的胞外環(huán)境有利于多種細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)、遷移和分化。膠原主要包括I型膠原，Ⅱ型膠原，Ⅲ型膠原，Ⅳ型膠原，Ⅴ型膠原，Ⅵ型膠原幾種。
I 型膠原—最常見的膠原蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和增殖，用于內(nèi)皮細(xì)胞，肝細(xì)胞，肌細(xì)胞等的培養(yǎng)。
軟骨細(xì)胞對(duì)II型膠原的黏附性較好；上皮細(xì)胞在Ⅳ型膠原底物上貼壁良好，而在I、II、III型膠原底物的培養(yǎng)板上貼壁情況較差。膠原應(yīng)用及建議細(xì)胞基質(zhì)濃度。
表1.不同膠原蛋白包被濃度
細(xì)胞外基質(zhì) | 建議濃度 | 內(nèi)皮細(xì)胞 | 上皮細(xì)胞 | 神經(jīng)元細(xì)胞 | 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 | 軟骨細(xì)胞 | 肝細(xì)胞 | 骨骼肌細(xì)胞 |
Collagen I | 0.2-10μg/cm2 | |||||||
Collagen Ⅱ | 5μg/cm2 | |||||||
Collagen Ⅲ | 0.2-10μg/cm2 | |||||||
Collagen Ⅳ | 1-10μg/cm2 | |||||||
Collagen Ⅵ | 1-5μg/cm2 |
PART3
纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）
細(xì)胞纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）是一種細(xì)胞外糖蛋白，分別以可溶形式存在于體液中，或以不可溶形式存在于細(xì)胞外基質(zhì)中。作為主要的細(xì)胞粘附分子之一，F(xiàn)N 在許多重要的生理過程中起著關(guān)鍵性作用，如胚胎生成，傷口愈合，止血和血 栓形成。纖連蛋白表達(dá)的改變，降解以及組合與大量的病理發(fā)生密切相關(guān)，包括癌癥和纖維化。
重組纖維連接蛋白，可作為一種細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，替換Matrigel、鼠尾膠原、血源纖連蛋白等，提高細(xì)胞貼壁率，增強(qiáng)細(xì)胞代謝水平，縮短細(xì)胞生長(zhǎng)周期。也可直接添加到培養(yǎng)基中，替換或降低血清使用量，促進(jìn)細(xì)胞貼壁、遷移、移動(dòng)生長(zhǎng)、維持細(xì)胞狀態(tài)。
Human FN包被方法（以6孔板為例）
母液配制：用20mM 檸檬酸鹽，250mM NaCl，pH7.2~7.4溶解重組人纖維連接蛋白(rFN)，建議配置 1mg/mL 的儲(chǔ)存液。母液按照單次使用劑量，分裝凍存于-20 ℃，避免反復(fù)凍融；
取出適量的重組人纖維連接蛋白（rFN），用無菌1×PBS，pH 7.2~7.4稀釋至工作液濃度，終濃度參考范圍50~100 μg/mL?；靹蚝螅尤氲?孔板中，800μL/孔，保證工作液全覆蓋6孔板底部；
將加有rFN工作液的6孔板，放置在4 ℃過夜或者37 ℃包被1 h；
收集6孔板中的工作液，放置4 ℃保存，一周內(nèi)可用于其他培養(yǎng)瓶/板包被；
取出rFN包被后的6孔板，加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)基后，可直接接種細(xì)胞，rFN促進(jìn)細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)等；
若包被后的6孔板暫不使用，放置在4 ℃密封保存，建議一周內(nèi)使用完。
【注】：包被/鋪板實(shí)驗(yàn)中，重組人纖維連接蛋白（rFN）工作液的加入量，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)皿/瓶的大小進(jìn)行調(diào)整，請(qǐng)參見下表2。
表2. 重組人纖維連接蛋白包被濃度
培養(yǎng)皿 | 底面積 (cm2) | 推薦rFN工作液加入量 |
96孔板 | 0.32 | 50 μL |
24孔板 | 2 | 200 μL |
12孔板 | 4.5 | 400 μL |
6孔板 | 9.6 | 800 μL |
35 mm培養(yǎng)皿 | 8 | 600 μL |
60 mm培養(yǎng)皿 | 21 | 1.6 mL |
25 cm2培養(yǎng)瓶 | 25~28 | 2.0 mL |
玻連蛋白（Vitronectin），又稱S-蛋白或血清擴(kuò)散因子，是一種在肝臟中合成的分泌型糖蛋白，屬于小分子蛋白，借由Vitronectin 受體讓細(xì)胞貼附于細(xì)胞基質(zhì)中，主要促進(jìn)細(xì)胞遷移，增加細(xì)胞貼附性、細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長(zhǎng)分化等，并協(xié)助細(xì)胞間的訊號(hào)傳遞。
Human VTN蛋白包被方法
本方案僅作參考，具體包被條件需要根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化
取出重組人玻連蛋白，用無菌1×PBS，復(fù)溶至濃度0.1- 1 mg/mL?；靹蚝?，用培養(yǎng)基稀釋至5- 20μg/mL工作液濃度；
根據(jù)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)器皿，參考下表3.建議的包被量進(jìn)行包被。包被時(shí)，使包被液均勻覆蓋在培養(yǎng)皿表面，37℃孵育1小時(shí)以上。37℃過夜包被，效果更佳；
使用時(shí)，吸去培養(yǎng)容器表面的Human VTN工作液，將細(xì)胞直接接種到培養(yǎng)器皿中。
【注】：VTN的工作濃度與不同細(xì)胞系密切相關(guān)，請(qǐng)根據(jù)不同細(xì)胞系對(duì)VTN包被濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。避免使用在4℃保存24小時(shí)以上的、配制好的VTN包被液進(jìn)行包被。
表3. Human VTN 包被不同培養(yǎng)器皿的建議使用體積
層粘連蛋白（Laminin）
層粘連蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成，存在于所有上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的基底側(cè)，同時(shí)也是某些細(xì)胞與細(xì)胞間交互作用的中間媒介。層粘連蛋白對(duì)于生物活性至關(guān)重要，影響細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、遷移和粘附等。層粘連蛋白是一種細(xì)胞外基質(zhì)多結(jié)構(gòu)域三聚糖蛋白，是基底層的主要非膠原成分，支持粘附、增殖和分化。層粘連蛋白由A、B1和B2鏈組成，這些鏈由許多二硫鍵連接。層粘連蛋白支持多種細(xì)胞類型的生長(zhǎng)和分化，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和肝細(xì)胞。Laminin 521已成為大規(guī)模擴(kuò)增誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC) 最有前景的涂層系統(tǒng)。
Laminin 521一般使用步驟（僅供參考）：
用Laminin 521包被細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)（常見用量為0.5 μg/cm2，具體視實(shí)驗(yàn)而定）；
清洗細(xì)胞，加入消化酶或EDTA孵育；
分離成單細(xì)胞懸液，離心，并在合適的新鮮培養(yǎng)基中重懸；
將細(xì)胞接種在已用Laminin 521包被的培養(yǎng)介質(zhì)上。。
Poly-D-lysine 多聚-D-賴氨酸
和Poly-L-lysine 多聚-L-賴氨酸
Poly-lysine多聚賴氨酸，是一種帶正電荷的氨基酸聚合物，包被在培養(yǎng)器皿表面，不僅能促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，還能加強(qiáng)對(duì)血清蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的吸附，也可用作組織學(xué)分析的粘片劑。多聚賴氨酸分為D型和 L型。
Poly-D-lysine多聚-D-賴氨酸（PDL）和Poly-L-lysine多聚-L-賴氨酸（PLL）分子量為150000~300000，都可促進(jìn)細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，常用的濃度是0.1 mg/mL。2個(gè)產(chǎn)品的區(qū)別在于PDL不會(huì)被細(xì)胞吸收，但PLL可以被某些細(xì)胞吸收，攝入過多會(huì)產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性。
細(xì)胞培養(yǎng)一般步驟如下：
用PBS或者無菌水將poly-D-lysine或者poly-L-lysine配制成濃度為0.1 mg/mL的溶液后進(jìn)行無菌過濾；
將過濾后的poly-D-lysine/poly-L-lysine溶液倒入培養(yǎng)器皿，使用量為0.5~1.0 mL/25cm2，輕輕搖晃，使其均勻覆蓋在培養(yǎng)器皿表面；
5~10 min后，用移液器吸出溶液，用PBS清洗培養(yǎng)器皿表面；
干燥2~3h后，可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
相關(guān)產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 目錄價(jià)（元） | 價(jià)（元） |
重組人玻連蛋白（Vitronectin） | 92549ES10/60 | 10μg/100μg | 255/985 | 128/493 |
重組人纖連蛋白（Fibronectin） | 40113ES03/10 | 1mg/10mg | 655/3355 | 528/2688 |
重組人層粘連蛋白521（Laminin 521 ） | 92602ES10/60 | 10μg/100μg | 575/2285 | 288/1143 |
大鼠鼠尾膠原蛋白I（Collagen, Type I） | 40125ES10/50 | 2mL/10 mL | 586/2236 | 380/1520 |
小鼠鼠尾膠原蛋白I（Collagen, Type I） | 40136ES10/50 | 2mL/10 mL | 685/2685 | 615/2415 |
重組人III型膠原蛋白（Type III Collagen） | 92616ES50/72 | 50μg/250μg | 485/1215 | 240/608 |
多聚-D-賴氨酸 (Poly-D-lysine) | 60715ES08/10/50 | 5mg/10mg | 455/725 | 364/580 |
多聚-L-賴氨酸 (Poly-L-lysine) | 60716ES08/10/50 | 5mg/10mg | 385/635 | 308/508 |
