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上期，我們介紹了酶定向進化的突變體文庫構建技術（點擊查看詳情）。高質量的突變體文庫是定向進化的基礎，與之相匹配的是高效、靈敏的突變體篩選技術手段。根據突變體酶參與反應的場所來區分，篩選技術可分為體內和體外篩選，篩選的通量和準確度正隨著技術的不斷升級而提升。
體內篩選是由菌株篩選衍生而來，目標酶活性與菌株生長、環境中底物代謝程度相關，性能缺陷的酶不足以支撐宿主形成單克隆，或無法使底物發生顯著變化。該方法適用于篩選與細菌生長、抗生素耐受等關鍵代謝途徑相關的酶，或可使底物發生顯著顏色變化的蛋白。不過，由于微生物可調整自身代謝流以適應環境，且存在多種補償途徑，菌株表現的優勢可能并非僅僅是目標酶的貢獻。
2011年，David Liu團隊開發了PACE系統（噬菌體輔助連續進化，Phage-assisted continuous evolution）用于T7 RNA聚合酶的馴化。PACE以M13絲狀噬菌體為載體，將目標酶的活性與子代噬菌體的數量相關聯。其設計原理如圖1b所示，T7 RNA聚合酶基因取代了噬菌體的衣殼蛋白基因gIII，并受gIII的啟動子控制，gIII基因則安裝在輔助質粒上，受T7啟動子控制。重組噬菌體侵染宿主后gIII啟動子開放，T7 RNA聚合酶水平上升，進而介導GIII蛋白大量表達，T7 RNA聚合酶基因被包裝在子代噬菌體內。聚合酶活性越高，產生的活性子代噬菌體顆粒越多，相應突變體序列便隨代次增加而逐漸富集。不僅如此，PACE系統還包含了誘變質粒MP（Mutagenesis plasmid），多個誘變基因在L-阿拉伯糖的誘導下，介導包含目的基因在內的全基因組范圍的堿基突變。在連續流加培養體系中，基因組上積累了突變的大腸桿菌不斷被新鮮的細胞稀釋取代，用來給子代噬菌體提供優質的宿主，而攜帶突變的噬菌體持續侵染并疊加新的突變，實現目的基因的連續篩選和進化（圖1a）。利用PACE系統，項目組成功地馴化了可以識別T3啟動子的T7 RNA聚合酶突變體。
圖1. PACE進化系統
（圖片源自：doi: 10.1038/s41596-020-00410-3.）
PACE系統憑借快速、自動化的優勢被迅速推廣，適用于RNA聚合酶、蛋白酶、tRNA合成酶等酶的進化，以及一些與DNA、蛋白相互作用的蛋白質的篩選（圖1c）。同時，在GIII的拮抗蛋白GIII-neg的輔助下，PACE系統可以更靈活地用于提升多種酶的不同性能（圖1d）。盡管如此，那些無法關聯到gIII或其他噬菌體基因表達過程的蛋白依然難以用PACE系統進行篩選，并且所有會導致大腸桿菌生長異常的選擇壓力都難以應用。
圖2. HaeIII甲基轉移酶的篩選
（圖片源自：doi: org/10.1038/nbt0798-652.）
圖3. 分隔自復制系統
（圖片源自：doi: 10.1073/pnas.071052198.）
以流式分選技術為例，只要酶性能與細胞的大小、形狀、熒光強度或表面修飾狀態相關聯，當細胞流經監測口時儀器就能采集相關信號并借助電荷和磁場的作用，實現目標細胞的分選。而適用于微米級微生物分選的FADS（Fluorescence-Activated Droplet Sorting）及其衍生系統（AADS、BADS、MADS）則是另一種技術，為流式分選和液滴技術的結合。微生物細胞和底物分散在反應緩沖液中作為水相流入PDMS芯片中，油相則從垂直方向進入，通過調整兩種液體的流速，水相被均勻地分割為20-50 μm大小的液滴。不同于耐熱的CSR體系，液滴分選系統的細胞破碎只能依賴溶菌酶或其他化學試劑。為了防止細胞在進入液滴前裂解，溶菌試劑推薦使用再注入的方法輸入液滴，或使用替代方案先將溶菌組分與細胞混合，再將反應底物注入液滴。隨后液滴在合適條件下脫機孵育，催化反應將使液滴內的濁度、pH值、熒光信號強度、特征化合物的量發生顯著變化，超過設定閾值的液滴將在電場或氣流的作用下發生偏轉，流入收集管內（圖4）。收集的完整細胞可直接涂布培養，破碎的細胞則只能擴增回收DNA用于后續實驗。
圖4. 液滴分選
（圖片源自：doi: 10.1016/j.tibs.2021.11.001.）
液滴分選系統具有以下優勢：直接檢測產物，可準確反應酶學性能的變化；皮升級的液滴反應器可大幅度節約試劑成本（~10^6倍）；最多可實現10^8/day的液滴分選；可通過設計芯片結構、調整模塊組合來適配多種酶的篩選場景。
針對以上介紹的不同突變體文庫篩選方法總結如下表，實際可根據不同需求選擇。
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