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ATCC細胞冷凍？又如何解凍？
閱讀：966 發布時間：2014-1-10時間過的可真快呀，一月份都已經過去三分之一啦，等待春節的到來，真是激動人心的，元旦剛過，就是臘八節了，我公司還開展了臘八*一周的*活動哦！想了解的朋友們可以。
在昨天下午的時候，我公司接到了一個咨詢有關細胞冷凍的朋友來電，我公司很快地到了技術部人員為這位朋友解決了問題。細胞也為我公司主營產品之一，我公司王提出應將ATCC細胞冷凍及解凍方法發布出來分享給其他的朋友們。
ATCC細胞冷凍？又如何解凍？
細胞冷凍及保存
材料：
生長良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO、無菌塑料冷凍保存管、0.4％（w/v）trypan blue、血球計數盤與蓋玻片、等速降溫機。
冷凍保存方法：
1、傳統方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時（或隔夜）→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
2、程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。
步驟：
1、冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。
2、配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養基中，zui后濃度為5～10％，混合均勻，置于室溫下待用。
3、依細胞繼代培養之操作，收集培養之細胞，取少量細胞懸浮液（約0.1ml）計數細胞濃度及凍前存活率。
4、離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。
朋友們可要注意嘍：
1、欲冷凍保存之細胞應在生長良好（logphase）且存活率高之狀態，約為80–90％致密度。
2、冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
3、注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色（以0.22micron FGLP flon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650），以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。
ATCC細胞
冷凍保存之細胞濃度：
1、normal
human fibroblast:1～3×106cells/ml
2、hybridoma：1～3×106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。
3、adherent tumor
lines：5～7×106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
4、other
suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
5、冷凍保護劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。
冷凍細胞活化
1、冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。
2、細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常（例如產生單株抗體或是其它蛋白質）。
材料：37℃恒溫水槽、新鮮培養基、無菌吸管/離心管/培養瓶、液氮或干冰容器 。
步驟：
1、操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
2、自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。
3、將新鮮培養基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。
4、取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。
5、取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內（稀釋比例為1：10～1：15），混合均勻，放入CO2培養箱培養。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試。
6、解凍后是否立即去除冷凍保護劑（例如DMSO或glycerol），依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養基之離心管內，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入CO2培養箱培養。
7、若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養后隔日更換培養基。
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