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考馬氏亮藍G－250染色法使用方法
閱讀：4117 發(fā)布時間：2013-5-23考馬氏亮藍G－250染色法使用方法
【操作步驟】
1、標準曲線的制備：
按下表操作，在試管中分別加入0、20、40、80、100微克蛋白標準溶液，用水補足到100微升，加入3ml的染色液，混勻后室溫放置15分鐘。
| 編 號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 蛋白標準（ml） | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.10 |
| 蒸餾水（ml） | 0.10 | 0.08 | 0.06 | 0.04 | 0.02 | 0 |
| 染色液（ml） | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
在595nm波長比色，讀出吸光度，以各管的標準蛋白濃度為橫坐標，以其吸光度為縱坐標繪出標準曲線。
2、血清蛋白質測定
稀釋血清（或其它蛋白樣品溶液），準確吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度（此為稀釋500倍，其它蛋白樣品酌情而定）。再取三只試管，分別標以1、2、3號，按下表操作。混勻后室溫放置15分鐘，在595nm波長比色，計算蛋白質濃度。
| 試劑（毫升） | 1（空白管） | 2（標準管） | 3（樣品管） |
| 蒸 餾 水 | 0.1 | — | — |
| 蛋白質標準 | — | 0.1 | — |
| 稀釋血清 | — | — | 0.1 |
| 染 色 液 | 3 | 3 | 3 |
【原 理】
考馬氏亮藍G－250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當它通過疏水作用與蛋白質結合后，變成藍色，zui大吸收波長從465nm轉移到595nm處，在一定的范圍內，蛋白質含量與 595nm的吸光度成正比，測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。
【注意事項】
1、常用試劑的干擾：有些常用試劑在測定中會受到不同程度的干擾。Tris、巰基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢劑有較少影響，而1％SDS、1％ TritonX-100及1％Hemosol的干擾嚴重。
2、顯色結果受時間與溫度影響較大，須注意保證樣品與標準的測定控制在同一條件下進行。
3、考馬氏亮藍G－250染色能力很強，特別要注意比色杯的清洗。顏色的吸附對本次測定影響很大。可將測量杯在0.1mol/L HCl中浸泡數(shù)小時，再沖洗干凈即可。
【試 劑】
1、考馬氏亮藍G－250染色液：
稱取100mg考馬氏亮藍G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100 毫升85％的磷酸，加入稀釋到1升。
2、蛋白標準（0.1mg/ml）
準確稱取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理鹽水至刻度，溶后分裝，－20℃冰箱保存。
【計 算】
每100毫升血清中蛋白質的含量（g％）
此方法是1976年Bradform建立。染料結合法測定蛋白質的優(yōu)點是靈敏度較高，可檢測到微量蛋白，操作簡便、快迅，試劑配制極簡單，重復性好，但干擾因素多。