化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
糖基化分析技術(shù)
閱讀：847 發(fā)布時間：2024-8-16當碳水化合物以共有序列天冬酰胺-X-絲氨酸/蘇氨酸連接到天冬酰胺上時，就會發(fā)生N-糖基化，其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸。當表達的蛋白在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成時，發(fā)生了預先形成的脂質(zhì)固定保守聚糖的整體轉(zhuǎn)移。當合成的蛋白質(zhì)通過高爾基體進入時，保守的N-連接的glyan被酶（糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶）“加工"。這些加工酶的存在，它們的相對水平以及蛋白質(zhì)上糖基化位點對這些酶的可及性決定了蛋白質(zhì)的最終糖基化類型。O-糖基化發(fā)生在氨基酸絲氨酸和蘇氨酸上，但不符合線性共有序列。有一些控制該過程的規(guī)則，如：糖基化區(qū)域內(nèi)經(jīng)常有附近的脯氨酸氨基酸，絲氨酸和茶氨酸的串聯(lián)重復很常見。
一、N-聚糖
分析N-聚糖分析是最-活躍的研究領(lǐng)域。適用于N-糖基化分析的技術(shù)也適用于O-糖基化。哺乳動物中最-豐富的N-聚糖結(jié)構(gòu)是復雜類型，其中許多N-乙酰氨基葡糖結(jié)構(gòu)被附加到分子上，并與半乳糖，巖藻糖和唾液酸殘基一起延伸，形成兩個至四個觸角結(jié)構(gòu)。確切的結(jié)構(gòu)反映了表達過程中所用細胞類型中存在的酶的性質(zhì)，以及細胞所處的精確環(huán)境。國際協(xié)調(diào)會議（ICH）質(zhì)量指南Q6B描述了應(yīng)針對這些結(jié)構(gòu)進行的分析類型，以了解存在的不同類型單糖的量，聚糖的觸角分布特性和連接性每個結(jié)構(gòu)中的單糖含量，以及蛋白質(zhì)骨架上不同糖基化位點的聚糖結(jié)構(gòu)。
二、詳細信息的分析過程：
糖基化的分析涉及許多物理和酶促步驟，以釋放聚糖，然后將它們與肽和混合物中存在的任何O-糖肽分開。O-聚糖可以從O-糖肽中化學釋放，并與其余肽鏈分開純化。然后對分離的N-聚糖和O-聚糖進行全甲基化衍生，使它們可以使用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法（MALDI-MS）分析。也可使用色譜分析樣品。如，帶有脈沖安培檢測（HPAEC-PAD）的高pH陰離子交換色譜法可用于分析N-聚糖。該法在三種制劑中提供了一致的數(shù)據(jù)，代表2、3和4個唾液酸化聚糖的一系列簇峰。該分析根據(jù)所產(chǎn)生的產(chǎn)物給出了一些結(jié)構(gòu)信息，而對于聚糖的確切性質(zhì)卻給出的信息很少。因此，像這樣的技術(shù)對于比較工作很有用，但沒有提供太多表征分子的結(jié)構(gòu)信息。
三、使用質(zhì)譜表征
前述的過甲基化方法允許在非衍生化狀態(tài)下分離具有相似質(zhì)量的聚糖。如：兩種聚糖-具有相同的結(jié)構(gòu)，除了一個包含一個N-乙酰神經(jīng)氨酸（唾液酸）殘基，另一個包含兩個巖藻糖殘基-在天然狀態(tài)下，分子量僅相差1Da，但當相差13Da時，具有相同的結(jié)構(gòu)衍生化。基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-MS）分析可得出存在的聚糖的總體概況。使用光譜分析的峰（質(zhì)量），結(jié)合對N-聚糖，核心結(jié)構(gòu)和存在的生物合成途徑的了解，可以得出聚糖單糖的組成。
接下來，可使用電噴霧質(zhì)譜（ES-MS）裂解過甲基化的聚糖。斷裂路徑是明確定義的，根據(jù)斷裂發(fā)生的位置產(chǎn)生特定質(zhì)量。該過程取決于N-聚糖結(jié)構(gòu)的確切性質(zhì)，因此這些片段的質(zhì)量允許確定存在于聚糖上的觸角結(jié)構(gòu)。表征的最后一步是確定結(jié)構(gòu)中任何連接的立體特異性，其中數(shù)據(jù)表明可能存在潛在的免疫原性表位。用特定的糖苷外切酶處理聚糖并通過MS暴露前和暴露后進行分析可以通過顯示孵育后的質(zhì)量轉(zhuǎn)移來確認存在α-連接的半乳糖。
、針對以上技術(shù)資訊內(nèi)容，如果您有不太清楚或者了解更多信息(包括基本信息/技術(shù)資料/解決方案)，都可以隨時聯(lián)系我司業(yè)務(wù)員。我司提供的ELISA試劑盒種屬齊全，質(zhì)量有保障！提供全程技術(shù)指導及免費代檢測服務(wù)。