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磷酸鈣-DNA 共沉淀法

核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現時，可使DNA 附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內，進入細胞的DNA 僅有1%～5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA 可以與細胞DNA 整合，在細胞中進行穩定表達，基因轉導的頻率大約為10-4，這項技術能用于任何DNA 導入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉化的研究。此方法對于貼壁細胞轉染是zui常用并的方法。

1、配液

（1）2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na₂ PO4 、2H₂ O

加水至100ml pH7.1過濾，4℃保存

（2）2mmol/L CaCl₂ 過濾除菌

（3）TE：0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

（4）G418（新霉素G418）液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H₂O至10mL過濾除菌4℃保存。

（5）G418選擇培養基：用含10%胎牛血清的DMEM培養液配制G418，G418濃度為200～800mg/L

注意：對受體細胞先做預試驗，選用濃度為在10～14天內能殺死細胞50%以上的zui低濃度。

2、操作步驟[方法一]：

（1）供體DNA 制備：方法按前介紹的DNA 提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

（2）受體細胞的培養：研究癌基因轉移應選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細胞系等，該細胞有一定自發轉化傾向，一般在轉染前一天接種細胞，接種密度為2×104 /cm² ,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO₂ 培養，待細胞占50～70%瓶底面積時，用于轉染試驗。

（3）DNA -磷酸鈣沉淀物的制備

①將供體細胞DNA 和PSV2-neo質粒載體DNA 用TE配制成40mg/L的DNA 溶液，同時向供體細胞DNA 液200μl中加入帶基因neo質粒DNA 液（20mg/L）220μl和2×HBS 250μl（PSV2-neo為1～2mg/L的使用量）。

②取500μl上述DNA 溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl₂ 混勻30秒。

③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉染受體細胞。

（4）轉染受體細胞

①將處于對數生長期已占瓶底50～70%的受體細胞，在轉染前4小時更換一次新鮮培養基，每瓶5ml（25ml培養瓶）。

②吸取0.5ml DNA -磷酸鈣沉淀，加入含5ml培養液的細胞瓶中搖勻。

③置37℃ 5% CO₂ 培養24h或更長，使細胞充分吸入DNA -磷酸鈣結晶顆粒。

④更換新鮮培養基，繼續培養24小時，誘導轉染基因的表達。

⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養液進行篩選。同時設有未能轉染的對照細胞。

⑥培養大約3～5天，對照細胞大部分死亡，這時轉染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養基，每3～4天更換一次選擇培養基。

⑦2周后對照細胞死亡，在轉染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆 出現，待其增大后再進行化和擴大培養，可建立轉化細胞株，并做進一步鑒定。

本實驗要加入PSV2-neo、DNA 與外源DNA 共轉染受體細胞，這樣可使受體細胞獲得新霉素（neo）基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現明顯的“轉化灶”，也可測出轉入的外源性基因的抗neo的標記。而且還可利用被neo基因導入的受體細胞通過G418選擇培養篩選轉化的細胞建立細胞株。若以獲取“轉化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA 只需將從癌細胞中提取的DNA 導入受體細胞即可，其方法如下：

3、DNA 轉染[方法二]：

（1）配制磷酸轉染液

NaCl 8.0g

Hepes 5.0g 用時現配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65

Na₂HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存備用

加溫水至 1000ml

（2）按前面介紹的方法提取癌細胞DNA 。

（3）取供體DNA 50～100μg,加3M NaCl或醋酸鈉，使zui終濃度至0.3M混勻。

（4）再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。

（5）加入轉染緩沖液，待DNA 充分溶解后，再加入2.5MCaCl₂ ,含zui終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次（不用攪拌器以防DNA 袢結），置室溫下10～30分鐘，待液體透明度降低，出現微濁蘭色時，即可用于轉染細胞。

（6）取生長狀態良好處于半匯合階段的對數生長期細胞，在轉染前4小時，更換培養液（5ml/瓶）1次。

（7）轉染：向每瓶中加DNA -磷酸鈣沉淀物0.5～1ml/瓶，置37℃作用4～6小時。

（8）培養：棄去培養液，用15%處理3分鐘，無血清培養漂洗1次，接近匯合時血清用量降至5%，培養2～3周。

（9）檢測：逐日觀察，待出現“轉化灶”后，分離，擴大培養建立轉化細胞株。

脂質體介導DNA 轉染法

脂質體（lipofectin regeant,LR）試劑是陽離子脂質體N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1:1（w/w）]。它適用于把DNA 轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下zui方便的轉染方法之一。轉染率高，優于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA 和RNA 轉染到各種細胞。

用LR進行轉染時，首先需優化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做：*，先要固定一個DNA 的量和DNA /LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA 可從1～5μg和孵育時間6小時開始，按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA 兩者*的劑量，確定出轉染時間（2～24小時）。因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24小時為宜。

細胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。

1、操作步驟[方法一]：

（1）：取6孔培養板（或用35mm培養皿），向每孔中加入2ml含1～2×10⁵ 個液，37℃CO₂ 培養至40%～60%匯合時（匯合過分，轉染后不利篩選細胞）。

（2）轉染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液（為轉染每一個孔細胞所用的量）A液：用不含血清培養基稀釋1-10μg DNA ，終量100μl，B液：用不含血清培養基稀釋2-50μgLR，終量100μl,輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現微濁現象，但并不妨礙轉染（如出現沉淀可能因LR或DNA 濃度過高所致，應酌情減量）。

（3）轉染準備：用2ml不含血清培養液漂洗兩次，再加入1ml不含血清培養液。

（4）轉染：把A/B復合物緩緩加入培養液中，搖勻，37℃溫箱置6～24小時，吸除無血清轉染液，換入正常培養液繼續培養。

（5）其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉染法相同。

注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。

2、快速脂質體轉染法操作步驟如下[方法二]：

（1）以5×10⁵ 細胞/孔接種6孔板（或35mm培養皿）培養24小時，使其達到50～60%板底面積。

（2）在試管中配制DNA /脂質體復合物方法如下：

①在1ml無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質粒DNA 或供體DNA 。

②旋轉1秒鐘，再加入脂質體懸液，旋轉。

③室溫下放置5～10分鐘，使DNA 結合在脂質體上。

（3）棄去細胞中的舊液，用1ml無血清DMEM洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入1ml DNA /脂質體復合物，37℃培養3～5小時。

（4）再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續培養14～24小時，

（5）吸出DMEM/DNA /脂質體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2ml/孔，再培養24～48小時。

（6）用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

穩定的脂質體轉染方法如下：

（1）接種細胞同前，細胞長至50%板底面積可用于轉染。

（2）DNA /脂質體復合物制備轉染細胞同前（2）、（3）步驟。

（3）在每孔中加入1ml、20%FCS的DMEM，37℃培養48小時。

（4）吸出DMEM，用G418選擇培養液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染克隆 ，方法參照細胞篩選法進行。

DEAE-葡聚糖轉染法

DEAE-葡聚糖介導的轉染，其原理還不清楚，可能是通過內吞噬作用而使DNA 轉導進入細胞核，此法只適合暫時轉染實驗，轉染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細胞與DNA /DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖（1g/L）作用較短時間（30分鐘-1.5小時），又可用較低濃度（250g/L）的DEAE-葡聚糖作用較長時間（8小時）。

方法如下：

（1）接種鼠L成纖維細胞濃度為5×10⁵ CO₂ /孔/皿生長2～3天，當達50%板底面積可用。

（2）乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo質粒DNA ，空氣干燥后溶于40μL的TE中，或取供體DNA 。

（3）用10ml 1×PBS、4ml、10%富合生長因子血清的DMEM洗板（皿）。

（4）在80μl熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA ，取120μl DNA /DEAE-葡聚糖加到每孔（皿）細胞中，使其分布均勻輕輕轉動直到顯示均勻一致的紅色，培養4小時。

（5）從孔（皿）中吸出DNA /DEAE-葡聚糖，加入5ml 10%DMSD，室溫放置1分鐘，吸出DMSO，用5ml 1×PBS洗一次吸出，加入10ml培養液（10%血清的DMEM）。

（6）培養細胞，在適當時間分析細胞，若含有抗藥基因，可用G418選擇培養液培養，方法同前。

*，科研工作者在進行醫藥方面的科學研究之前，需要制定完善的統計研究設計方案，那么什么樣的設計方案才稱得上是完善的呢？ 一般來說，完善的設計方案需具備以下幾個條件：實驗所需的人力、物力和時間資源；實驗設計的“三要素”和“六原則”均符合專業和統計學要求，對實驗數據的收集、整理、分析等有一套規范的規定和正確的方法。而其中準確把握統計研究設計的“三要素和六原則”，是科學實驗設計的核心。