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一、原理
SNP （Single Nucleotide Polymorphism）即單核苷酸多態性，是由于單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態性（Polymorphism）。據估計，在人類基因組中，大約每千個堿基中有一個SNP，無論是比較于限制性片段長度多態性（RFLP）分析還是微衛星標記（STR），都要廣泛得多。SNP是我們考察遺傳變異的zui小單位,據估計，人類的所有群體中大約存在一千萬個SNP位點。一般認為，相鄰的SNPs傾向于一起遺傳給后代。于是，我們把位于染色體上某一區域的一組相關聯的SNP等位位點稱作單體型（haplotype）。大多數染色體區域只有少數幾個常見的單體型（每個具有至少5%的頻率），它們代表了一個群體中人與人之間的大部分多態性。一個染色體區域可以有很多SNP位點，但是我們一旦掌握了這個區域的單體型，就可以只使用少數幾個標簽SNPs（tagSNP）來進行基因分型，獲取大部分的遺傳多態模式。
二、樣品準備
1. DNA抽提
① 1、取新鮮肌肉組織約100mg，PBS漂洗干凈，置于1.5ml離心管中，加入液氮，迅速磨碎。
② 加200μl 緩沖液GA，震蕩至*懸浮。加入20μl 蛋白酶K（20mg/ml）溶液，混勻
③ 加220μl 緩沖液GB，充分混勻，37℃消化，溶液變清亮。加220μl 無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。
④ 將上述一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB 中，（吸附柱放入廢液收集管中）12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
⑤ 加入500μl 去蛋白液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
⑥ 加入700μl 漂洗液GW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm離心30 秒，棄掉廢液。加入500μl 漂洗液GW, 12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。將吸附柱CB 放回廢液收集管中，12000rpm 離心2 分鐘，盡量除去漂洗液。
⑦ 將吸附柱CB 轉入一個干凈的離心管中，加入100μl 洗脫緩沖液（洗脫緩沖液應在60-70℃水浴預熱），混勻，室溫放置15 分鐘，12000rpm 離心30 秒。洗脫第二次，將洗脫緩沖液50μl 加入吸附柱中，室溫放置15 分鐘，12000rpm 離心30 秒。
⑧ 采用Beckman DU® 640 spectrophotometer 檢測提取到的基因組DNA 濃度，在OD260 處有顯著吸收峰。同時檢測純度，OD260/280 的值應為為1.7-1.9。
⑨ 從原液中取出相應體積DNA 溶液，稀釋致50ng/ul，原液置于-70℃保存，稀釋液置于-20℃保存。
2. PCR擴增目的片段
按相關的試劑說明在標準反應管中準備反應體系，典型的PCR反應體系如下（20ul體系）：
| 10×Buffer | 2ul |
| Taq酶 | 1ul |
| dNTP | 0.5ul |
| 上游引物 | 0.5ul |
| 下游引物 | 0.5ul |
| 無菌水 | 14.5ul |
| DNA模板 | 1ul |
向左扳動儀器蓋子上的手柄，揭開儀器蓋子，小心放置樣品管于儀器的相應樣品孔中，輕輕蓋上蓋子，將頂部的旋鈕慢慢旋緊，讓熱蓋緊密接觸樣品管，樣品放置完畢。
3. 在T1型PCR儀上編輯一個程序
按[C programs]進入編輯模式。要在主目錄中創建一個程序請按[D enter]。要進入一個子目錄，用→鍵將光標向右移動，然后用↑↓鍵選擇一個子目錄。按[D enter]進入選擇的子目錄。
輸入程序中要求的溫度：用[D enter]確認溫度。為其輸入時間，用小數點來間隔。順序為h.m.s。用[D enter]確認時間設置，或者用光標鍵移動到下一個區域。＃表示循環的次數。設定循環值=總循環值-1，即，總循環數為30時應輸入“29”。用[C pgm ok]來儲存一個完整的程序。程序數據*的儲存在記憶中。
4. 運行程序
按[B start/stop]選擇一個程序。用→↑↓鍵選擇一個子目錄，或者用[D enter]進入主目錄。輸入您想要啟動的程序的號碼。或者，按[A list]在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個程序。用↑↓鍵在列表中滾動選擇。用[D enter]確認用強光突出的程序。按[D start]啟動程序。
5. 控制測試過程
運行過程中，按A按鈕，可以獲得程序剩余的時間信息。運行完成后，按STOP按鈕終止實驗，按YES確認終止。小心旋開熱蓋，按照放置樣品的操作順序，打開蓋子，取出實驗樣品，再蓋上蓋子，關閉電源，本次實驗結束。
6. PCR產物測序
由專門負責測序的服務公司完成
7. 數據分析
少量可人工讀取，大量可軟件讀取。比對發現的SNP在基因組中的位置：重點是啟動子區、外顯子區域（包括編碼區的cSNP及5’及3’UTR）、剪切邊界等，密碼子的改變是否導致氨基酸的改變：錯義突變、無義突變、終止突變。
8. 注意事項
① 為保證待測目的區域測序真實可靠，引物設計應該使待測目的區域邊界距離上下游引物至少各50bp；
② 引物設計建議使用在線方式，以保證成功率；
③ 為保證測序敏感性，PCR產物片段大小應在250bp－650bp范圍；
④ 為方便實驗，建議引物合成時分裝成1 o.d/管，方便將PCR與測序的引物分開；
⑤ 為保證引物的特異性，建議引物設計后在NCBI上blast確認；
⑥ 為防止降解，PCR產物應盡快測序，否則應該保存在-20℃，且時間不宜過長；
⑦ 為保證結果真實性，建議對關鍵點進行反向測序確認。
