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技術(shù)文章

超聲波DNA打斷儀實驗案例

閱讀:3298          發(fā)布時間:2020-9-8

實驗案例

現(xiàn)在的高通量測序平臺(主要是illumina)在直接測序時只能測出200bp長度的序列,因此建庫方案是將DNA .片段化為200bp,然后深度測序后,后將序列拼接。我公司自主研發(fā)的非接觸聚能式超聲波DNA打斷儀可以在不接觸樣品的情況下隔著EP管將細胞DNA鏈至打斷至200bp或是更小。

 

實驗目的:將收集的細胞DNA..片段化

樣品:鼠源乳腺癌細胞4T1

人源肝癌細胞HepG2

人源耐藥子宮肉瘤細胞MES-SA/DX5

 

實驗步驟:

  • 交聯(lián): 取1皿細胞(10 cm平皿),10 mL培養(yǎng)基中加入270 uL  37%甲醛,使得甲醛的終濃度為1%,輕輕搖勻,37℃ 孵育10 min。
  • 終止交聯(lián):加甘氨酸至終濃度為0.125 M。550 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。輕輕搖勻,在室溫下放置5 min即可。
  •  棄凈培養(yǎng)基,用冰冷的含1 mM  PMSF 的PBS清洗細胞2次,每次5-10mL。
  •  加入3 ml冰冷的含1mM  PMSF的PBS,細胞刮刀收集細胞于離心管中,用PBS清洗培養(yǎng)皿兩次,收集到離心管中
  •  預冷后2000 rpm離心 5 min收集細胞。
  •  新鮮配置一定體積的蛋白酶抑制劑復合物和SDS Lysis Buffer充分混勻。
  •  棄上清,加入一定體積含有蛋白酶抑制劑復合物SDS Lysis Buffer,重懸細胞。
  •  冰上放置10min。
  •  開啟冷循環(huán)泵,并降溫至4℃以下。
  •  開啟超聲波DNA打斷儀,將程序調(diào)制循環(huán)模式,超聲20s停10s。 
  •  啟動機器至超聲結(jié)束。
  •  加解交聯(lián)試劑65℃ 解交聯(lián)4h以上,可過夜解交聯(lián)。
  •  將超聲過的樣品提取DNA. 片。
  •  1.5%-2%瓊脂糖凝膠電泳15min
  •  拍照。

人源骨肉瘤細胞U2OS

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