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技術(shù)文章

關(guān)于超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)菌

閱讀:4511          發(fā)布時間:2018-9-4

細(xì)菌工程菌胞內(nèi)表達(dá)主要分為兩種形式,一種是在強啟動子條件下的表達(dá),由于蛋白的過度表達(dá),使蛋白不能及時有效折疊而發(fā)生無規(guī)則卷曲,以固體顆粒的形式堆積于胞間質(zhì)中,這就是所說的包涵體,另外一種是間質(zhì)內(nèi)的可溶性表達(dá),即可以發(fā)生正常折疊,具有生物活性。一般情況下,細(xì)菌只要被正常破壁就可以通過離心的形式將包涵體和可溶性表達(dá)的蛋白分離開。

 

    超聲破碎的條件一般是300w10s/10s20分鐘,具體條件可根據(jù)自身情況而定。

 

    超聲前菌體的準(zhǔn)備:菌液離心后,先用PBS將菌沉淀洗2-3遍,然后按原菌液體積的1/5-1/10加入裂解液重懸菌體,裂解液的成分:50mMTris- HCl, pH8.0, 2mM EDTA100mM NaCl,加溶菌酶至100ug/ml0.1%Triton X-100。切記冰浴超聲!

 

一、如何判斷是否超聲*,根據(jù)經(jīng)驗,一般有以下幾個方面:

 

1,外  觀判 斷:超聲前菌懸液是渾濁的,超聲*后變的透明、清澈。

2,液體的粘性:超聲后菌液從槍頭滴下不粘連。

3,高 心:有用高速離心檢測超聲破碎程度的(一般用6,000 g 10 min, 比一般離心收集菌體的轉(zhuǎn)速高一點)。 沉淀是未破碎或破碎不*的菌體。

4,染         色:破碎后的菌液涂片,革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘,鏡檢。

(超聲后加入核酸酶消除核酸對蛋白的污染)

 

二、一些需要注意的問題:

 

1,蛋白以包涵體形式表達(dá),追求的是高破碎率,要求細(xì)胞碎片很小,而另一種蛋白是可溶形式表達(dá),所以細(xì)胞碎片不能很小,兩種情況要求不同但目的相同,都是便于后期的固液分離。

2,如果超聲時出現(xiàn)黑色沉淀,說明超聲功率太強。

3,超聲時間太長、功率太高對蛋白活性肯定有影響。

4,盡量防止泡沫的產(chǎn)生。

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