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甲基化檢測方法（亞硫酸氫鹽修飾后測序法）
點擊次數：2133 發布時間：2016-5-3
甲基化是目前的研究熱點，就我所做的一點工作并其中一點心得，與大家分享。希望能夠對大家有所幫助。
*部分 基因組DNA的提取。
這一步沒有懸念，*可以購買供細胞或組織使用的dna提取試劑盒，如果實驗室條件成熟，自己配試劑提取*可以。DNA比較穩定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應該是完整的。
此步重點在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶k及RNA酶以去除兩者。
使用兩者的細節：
1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml；
2：rna酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在購買市售RNA酶后進行再處理，配制成10mg/ml。否則可能的后果是不僅沒有RNA，連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存。
驗證提取DNA的純度的方法有二：
1：紫外分光光度計計算OD比值；
2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。
我傾向于第二種方法，這種方法*可以明確所提基因組DNA的純度，并根據Marker的上樣量估計其濃度，以用于下一步的修飾。
第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA
如不特別指出，所用雙蒸水（DDW）均經高壓蒸汽滅菌。
1：將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul；
2：加5.5ul新鮮配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期間配制：
4：10mM對苯二酚（氫醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液變成淡黃色）
5： 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，zui終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH后會慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要準確為5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。
7：加200 ul 石蠟油，防止水分蒸發，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm開始做，熟練的話不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，時間上很合適。
這一步細節：
1：基因組DNA的量不需十分，寧多勿少，因為在以后純化回收步驟中會有丟失，且此方法修飾zui多可至4ug。
2：所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術要過關，既要快，又要。
3：亞硫酸氫鈉溶液呈強酸性，一定用堿將PH調制5.0，否則PH不合適會影響后續純化吸收。
4：水浴達16小時，雖可以短至8小時，但后者修飾會有不*。
第三部分 修飾后DNA純化回收
EP管如無特別說明均為高壓蒸汽滅菌的。
1. 將移液器槍頭伸入石蠟油層下，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然后吸取混合液至一潔凈1.5mlEP管中。
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA純化回收系統（Promega，A7280）
1）70℃水浴預熱DDW；配制80%異丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，輕柔顛倒混勻，使DNA充分與樹脂結合；
3）由于該試劑盒中僅配備針筒沒有針栓，如果有真空負壓吸引器，使用起來很方便；如果沒有，需要自備3ml-5ml注射器。將注射器針筒與試劑盒提供的回收小柱緊密連接后，將上述混合物用移液器移至針筒內，用2ml以上的EP管放置小柱下接收廢液。加針栓，輕輕加壓，將液體擠出，此時可見小柱內有白色的樹脂沉積。
4）將注射器與小柱分離后拔出針栓，再將針筒與小柱連接，向針筒內加入2ml 80％的異丙醇，插入針栓，輕輕加壓，將異丙醇擠出。此為洗滌步驟。
5）將注射器與小柱分離，將小柱置于潔凈1.5ml潔凈EP管上，離心12000rpm，2min，以甩去殘余異丙醇成分，使樹脂干燥。此時，修飾后DNA處于與樹脂結合狀態。
6）將小柱取下置于另一潔凈1.5mlEP管上，移液器加50ul預熱好的DDW，室溫放置5min。
7）離心12000rpm，20s，此為洗脫步驟，此時EP管內液體即為洗脫的修飾后DNA溶液，終體積為50ul。
3：加5.5ul 新鮮配制的3M NaOH，室溫放置15min。
4：加33ul 10M乙酸銨，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。