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質粒的酶切鑒定及片段回收
點擊次數：1717 發布時間：2015-12-24
一、小量酶解反應
主要應用于質粒的酶切鑒定。10ul反應體積中含1mg DNA，酶切反應體系如下：
質粒dna 1mL
10×緩沖液 1mL
兩種限制酶各 0.5mL +0.5mL
雙蒸去離子水 7mL
總體積 10mL
[操作方法]
按下列順序加入試劑：
(1)在一滅菌的新的Ep管中加入7ul雙蒸水。
(2)加入10×緩沖液1mL 。
(3)加限制酶Kpn I 0.5mL，Sac I 0.5mL。
(4)zui后加入質粒DNA lmL。
(5)稍離心，混合。
(6)37℃水浴1—1.5h。
(7)取出后電泳分析鑒定是否酶解。
[注意事項]
(1)雙蒸水為可變體積，當其它反應成分確定后，用雙蒸水將反應體積補足。
(2)質粒DNAzui后加入，以防止操作不當引起試劑的污染。
(3) 大多數限制酶均加50％甘油緩沖液置于-20℃保存，其活力，穩定，但在配制反應混合物時，酶的加入量要準確限制小于總體積的l／10，否則甘油會抑制酶解反應。
二、凍溶法從瓊脂糖凝膠中回收DNA
在重組DNA或探針標記等實驗中，常常需要從凝膠中回收和純化DNA，常用的回收方法有：壓碎浸泡法、透析袋洗脫法、低熔點瓊脂糖法和DEAE—纖維素膜法等。
[操作方法]
(1) 從瓊脂糖凝膠中將含有擬回收DNA片段的膠塊切下，置于Ep管內。
(2) 用一次性注射器將膠由針頭處擠入Ep管內，加等體積Tris平衡酚混勻后，置液氮10min。
(3) 取出離心，5000g，5min。
(4) 小心地將水相轉移至另一Ep管中。
(5) 加等體積酚：氯仿（1：1）充分混勻。離心，5000g，5min。
(6) 將水相轉移Ep管中，加等體積氯仿：異戊醇（49：1）充分混勻。
(7) 離心，5000g，5min。
(8) 在轉移出的水相中加1／10體積3mol乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的預冷的無水乙醇置-30℃30min。
(9) 離心，12000g，15min．
(10)棄上清，加預冷的70％乙醇1ml，12000g，離心5min。棄上清，室溫放置數分鐘。
(11)將沉淀用20ul TE緩沖液(pH8.0)溶解，-20℃保存備用。