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基因克隆策略與引物設計原則
點擊次數：2318 發布時間：2015-11-19
1 功能基因克隆的基本策略
① 根據已知的脊椎動物某一特定基因的氨基酸序列的保守區域設計簡并引物，利用RT-PCR技術獲得該基因的核心片斷，將該片斷分離純化后與T載體連接，轉化大腸桿菌，挑取白色菌落，經 PCR反應鑒定得到陽性克隆，送陽性克隆的PCR產物去測序，從而獲得目的基因的cDNA核心片斷的序列。
② 利用3’-RACE 和5’-RACE 技術擴增cDNA的3’末端和5’末端，將cDNA核心片斷、3’末端和5’末端進行序列拼接，從而獲得全長cDNA序列。
③ 通過基因組PCR獲得內含子DNA序列，通過基因組步移技術進一步克隆該基因的5’側翼序列（含啟動子及其它順式調控）和3’ 側翼序列，從而獲得該基因的基因組DNA全序列。
2 引物設計基本原則
細心地進行引物設計是PCR 中zui重要的一步。理想的引物只跟目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會擴增出其他非目的序列。下面的指導描述了一個可以增加特異性引物所具有的令人滿意的特點：
① 典型的引物長18-24bp。引物足夠長，保證序列特異性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24bp 的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
② 選擇GC 含量為40%-60%。高GC 含量導致形成穩定的不正確的配對，而高AT 含量降低正確配對的Tm值。
③ 設計5’端和中間區為G 或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。
④ 避免多堿基序列（如poly dG）或者重復結構域的延伸——它們能夠在模板上進行不正確的配對。
⑤ 避免在PCR反應中使用與其它引物互補的序列，以阻止引物之間的配對，形成引物二聚體，抑制擴增。
⑥ 在引物5’末端加入限制性酶切位點序列時，一定要包含幾個額外的堿基（2-6堿基）作為固定，以防止5’末端在消化時的移動。