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技術(shù)文章
DNA 的純度和分子量的測定
點(diǎn)擊次數(shù)：2429 發(fā)布時間：2015-11-17
一、目的
熟練掌握瓊脂糖凝膠電泳法。
利用瓊脂糖凝膠電泳測DNA分子量和質(zhì)粒dna分子純度，并熟悉各種核酸分子在瓊脂糖凝膠電泳中的位置分布和某些特性。
二、原理
瓊脂糖是一種直鏈多糖。它是由B—D吡喃半乳糖和3，6—脫水半乳糖以1，3—β糖苷鍵相連的雙糖聚合物，鏈狀瓊脂糖分子之間相互以氫鍵交聯(lián)。形成網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。瓊脂糖帶有親水性，不含有帶電荷的基因，也不會引起核酸分子的變性，而且不吸附被分離的物質(zhì)，因此成為基因工程上的凝膠劑。
當(dāng)核酸分子在瓊脂糖凝膠電場中時，分子上帶電基團(tuán)在pH8.0條件下帶負(fù)電荷，在電場作用中移向正數(shù)，至使核酸分子在瓊脂糖凝膠電泳中有其遷移率。遷移率與下列因素有關(guān)：
1.核酸分子的大小：在相同的條件下，不同大小的核酸分子的遷移率不同，小分子的遷移率大，大分子的遷移率小。其中線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖上電泳的速度與線狀雙鏈DNA分子的分子量對數(shù)成反比（圖3－1）；所以根據(jù)遷移率大小可測定DNA分子的大小。
不過實(shí)際應(yīng)用時，通常將待測定的DNA和已知分子量大小的標(biāo)準(zhǔn)dna片段進(jìn)行電泳對照，觀察其遷移距離，就可知該樣品的分子量大小。
2、遷移率與核酸構(gòu)象有關(guān),瓊脂糖凝膠電泳可以鑒別分子量相同但構(gòu)型不同的DNA分子。在依常規(guī)方法抽提的質(zhì)粒DNA通常具有三種不同的構(gòu)象:超螺旋型（SC）、線形（L）和開環(huán)型（OC）。這三種構(gòu)型分子有不同的遷移率。在一般情況下,超螺旋型（SC）遷移速度zui快，其次為線狀（L）分子,zui慢的為開環(huán)型（OC）分子。若提取到的質(zhì)粒DNA樣品中,還有染色體DNA或RNA,在瓊脂糖凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶,由此可分析樣品的純度(圖3－2)。
圖3－2凝膠電泳，DNA移動距離和分子量關(guān)系（緩沖液0.5×TBE,0.5ug/ml溴化乙錠電泳條件1v/cm16小時）
DNA的純度和分子量的測定
圖3－3提純和未提純質(zhì)粒DNA電泳圖
熟練掌握瓊脂糖凝膠電泳法。
利用瓊脂糖凝膠電泳測DNA分子量和質(zhì)粒dna分子純度，并熟悉各種核酸分子在瓊脂糖凝膠電泳中的位置分布和某些特性。
二、原理
瓊脂糖是一種直鏈多糖。它是由B—D吡喃半乳糖和3，6—脫水半乳糖以1，3—β糖苷鍵相連的雙糖聚合物，鏈狀瓊脂糖分子之間相互以氫鍵交聯(lián)。形成網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。瓊脂糖帶有親水性，不含有帶電荷的基因，也不會引起核酸分子的變性，而且不吸附被分離的物質(zhì)，因此成為基因工程上的凝膠劑。
當(dāng)核酸分子在瓊脂糖凝膠電場中時，分子上帶電基團(tuán)在pH8.0條件下帶負(fù)電荷，在電場作用中移向正數(shù)，至使核酸分子在瓊脂糖凝膠電泳中有其遷移率。遷移率與下列因素有關(guān)：
1.核酸分子的大小：在相同的條件下，不同大小的核酸分子的遷移率不同，小分子的遷移率大，大分子的遷移率小。其中線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖上電泳的速度與線狀雙鏈DNA分子的分子量對數(shù)成反比（圖3－1）；所以根據(jù)遷移率大小可測定DNA分子的大小。
不過實(shí)際應(yīng)用時，通常將待測定的DNA和已知分子量大小的標(biāo)準(zhǔn)dna片段進(jìn)行電泳對照，觀察其遷移距離，就可知該樣品的分子量大小。
2、遷移率與核酸構(gòu)象有關(guān),瓊脂糖凝膠電泳可以鑒別分子量相同但構(gòu)型不同的DNA分子。在依常規(guī)方法抽提的質(zhì)粒DNA通常具有三種不同的構(gòu)象:超螺旋型（SC）、線形（L）和開環(huán)型（OC）。這三種構(gòu)型分子有不同的遷移率。在一般情況下,超螺旋型（SC）遷移速度zui快，其次為線狀（L）分子,zui慢的為開環(huán)型（OC）分子。若提取到的質(zhì)粒DNA樣品中,還有染色體DNA或RNA,在瓊脂糖凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶,由此可分析樣品的純度(圖3－2)。
圖3－2凝膠電泳，DNA移動距離和分子量關(guān)系（緩沖液0.5×TBE,0.5ug/ml溴化乙錠電泳條件1v/cm16小時）
DNA的純度和分子量的測定
圖3－3提純和未提純質(zhì)粒DNA電泳圖