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水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA
點擊次數(shù)：1785 發(fā)布時間：2015-6-9
實驗原理
閉合環(huán)狀質(zhì)粒、線性質(zhì)粒和開環(huán)質(zhì)粒DNA由于構(gòu)形不同，在加溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)不同的遷移率，因而在紫外燈下觀察，能區(qū)別閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（cccDNA）、線性質(zhì)粒DNA（L-DNA）和開環(huán)質(zhì)粒DNA（ocDNA）。
實驗步驟
1. 選擇合適的水平式電泳槽，調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平。檢查穩(wěn)壓電源與正負極的線路。
2. 選擇孔徑大小合適的點樣梳子，垂直架在電泳膠模的一端，使點樣梳子底部離電泳膠模底部的距離為1.0 mm。
3. 制備0.7%瓊脂糖凝膠，100℃水浴加熱至瓊脂糖融化均勻。
4. 用吸管取少量瓊脂糖凝膠溶液將電泳膠模四周密封好，防止?jié)补喹傊悄z板時發(fā)生滲透。待瓊脂糖凝膠冷卻至60℃左右時，加入一滴溴化乙錠，搖勻，輕輕倒入電泳膠模中，瓊脂糖凝膠的厚度在3~5 mm。倒膠時要避免產(chǎn)生氣泡，若有氣泡可用吸管小心吸去。
5. 瓊脂糖凝膠凝固后，在室溫放置20分鐘，小心拔掉點樣梳子和電泳膠模兩端的擋板，保持點樣孔的完好。
6. 將電泳膠模放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，使電泳緩沖液面高出瓊脂糖凝膠表面1~2 mm。如點樣孔內(nèi)有氣泡，用吸管小心吸出，以免影響加樣。
7. 將15mlDNA樣品與1/5體積的溴酚藍指示劑點樣緩沖液混合。上樣緩沖液不僅可以提高樣品的密度，使樣品均勻沉到樣品孔內(nèi)，還可以使樣品帶顏色，便于上樣和估計電泳時間和判斷電泳的位置。
8. 用微量移液器將樣品小心加入加樣孔內(nèi)，記錄樣品點樣秩序。
9. 蓋上電泳槽，開啟電源開關(guān)，zui高電壓不超過5 V/cm（100~150 V恒壓電泳），使DNA從負極向正極移動。
10. 電泳時間隨實驗的具體要求而異。電泳一般需1~3小時。電泳完畢后關(guān)閉電源，戴一次性塑料手套取出凝膠，盡可能將所有的電泳緩沖液淋干，在254 nm 波長的透射紫外燈下觀察。
提示
一、瓊脂糖凝膠電泳
1. 瓊脂糖凝膠的性質(zhì)
瓊脂糖是從海藻中提取的一種直鏈多糖，它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成的線型多聚糖。當(dāng)瓊脂糖加熱至90～100℃左右，即可形成清亮透明的液體。澆在模板上冷卻至40～45℃時，凝固形成凝膠。瓊脂糖帶有親水性，不含有帶電荷的基團，不引起DNA變性，又不吸附被分離的物質(zhì)，因此它是一種很好的凝膠劑。瓊脂糖凝膠可區(qū)分相差100bp的DNA片段。
2. DNA分子的遷移率
DNA分子在電泳中的遷移率的因素是多方面的，除了決定于DNA分子大小與構(gòu)型外，還有瓊脂糖凝膠的濃度、電壓大小、緩沖液pH值和電泳時的溫度等。
二、實驗操作中注意的問題
1. 加熱溶解瓊脂糖時應(yīng)不斷地搖動容器，使附于壁上的顆粒也*溶解。
2. 溴化乙錠是一種強致癌劑，并有中度毒性，因此必須十分謹慎小心。操作時一定要戴手套，用過的手套要及時將手套順手翻過來，讓污染有溴化乙錠的面朝里。
3. 用254 nm 波長的紫外光進行觀察的效果比366 nm 清晰，但產(chǎn)生的切口DNA量也較高。紫外光對眼睛有害，觀察時應(yīng)戴上眼鏡或防護面罩。
編輯： 趙棟2012