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考馬斯亮蘭法（Bradford法）測定蛋白濃度
點擊次數：1402 發布時間：2015-4-24
(一)實驗原理
雙縮脲法(Biuret法)和Folin?酚試劑法(Lowry法)的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法(Bradford法)，是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度zui高的蛋白質測定法。
考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的zui大吸收峰的位置(lmax)，由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。
在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。
Bradford法的突出優點是:
(1)靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其zui低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質-染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。
(2)測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性。因而*不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。
(3)干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
此法的缺點是:
(1)由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作 標準曲線時通常選用 g?球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。
(2)仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有:去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣)。
(3)標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。
(二)試劑與器材
1.試劑:
(1)標準蛋白質溶液，用 g?球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標準蛋白質溶液。
(2)考馬斯亮蘭G-250染料試劑:稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。
2.器材:
(1)可見光分光光度計 (2)旋渦混合器 (3)試管16支
(三)操作方法
1.標準方法
(1)取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標準蛋白質溶液給各試管分別加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補充到0.1ml。zui后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G-250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。
(2)加完試劑2~5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A595，空白對照為第1號試管，即0.1mlH2O加5.0mlG-250試劑。
注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。
(3)用標準蛋白質量(mg)為橫座標，用吸光度值A595為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。
2.微量法
當樣品中蛋白質濃度較稀時(10-100mg/ml)，可將取樣量(包括補加的水)加大到0.5ml或1.0ml，空白對照則分別為0.5ml或1.0ml H2O，考馬斯亮藍G-250試劑仍加5.0ml，同時作相應的標準曲線，測定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。