QQ交談
您所在位置：請輸入產品關鍵字：
郵編：200431
聯系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機：13122441390 15900755943
留言：發送留言
個性化：www.shifengsj.com
網址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://www.js967.com/st236594/
蛋白定量技術
點擊次數：890 發布時間：2015-4-14
（一）雙縮脲測定法
1．原理 蛋白質中的肽鍵有雙縮脲反應，在堿性溶液中與二價銅離子形成藍紫色的絡合物，在一定的范圍內，顏色的深淺與蛋白質的含量成正比。此法特異性強，游離的氨基酸、小肽和核酸均不產生這種反應，但此法不夠敏感，僅能測出毫克水平。
2．試劑配制
硫酸銅（CuSO4 .5H2O） 1.50g
酒石酸鉀鈉 5.00g
H2O 500.0ml
10%氫氧化鈉（不含硫酸鈉）300ml
H2O 加至 1 000ml
此溶液可長期保存，如產生暗紅色沉淀，則應廢棄重配。
3．標準曲線的制備
⑴ 準確稱取牛血清白蛋白1.0g（必要時須首先采用凱氏定氮法測定牛血清白蛋白制品中實際純蛋白含量，然后換算），以生理鹽水配成1%的濃度。
⑵ 將1%的牛血清白蛋白按表8-1進行稀釋：
表8-1 牛血清白蛋白稀釋方法表
成 分 | 試 管 號 | ||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
1％蛋白 液（ml） | 1.0 | .09 | 0.8 | 0.7 | 0.6 | 0.5 | 0.4 | 0.3 | 0.2 | 0.1 | － |
蛋白 含量（mg） | 10 | 9 | 8 | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 | － |
生理鹽水（ml） | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 | 1.1 | 1.2 | 1.3 | 1.4 | 1.5 |
雙縮脲試劑（ml） | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
試劑蛋白 含量（mg） | 8.0 | 7.2 | 6.4 | 5.6 | 4.8 | 4.0 | 3.2 | 2.4 | 1.6 | 0.8 | 0 |
注：1%牛血清白蛋白，經凱氏定氮測定含純蛋白為80%。
⑶ 混勻后于室溫放置0.5h～1h，光電比色（540nm），順序由低濃度至高濃度，每管測3次，求其平均值。
⑷ 以OD值為縱坐標，蛋白含量為橫坐標繪制標準曲線。
4．樣品測定
⑴ 取樣品0.1ml，加生理鹽水1.4ml。也可將樣品做1-10稀釋加1ml，再加生理鹽水0.5ml。
⑵ 加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，至室溫0.5h～1h。
⑶ 另以1.5ml生理鹽水加4.0ml雙縮脲試劑作為空白對照。
⑷ 測OD540 值。
⑸ 根據OD值從標準曲線上查出蛋白含量。
注意：各種雙縮脲試劑的配法、加量及室溫靜置時間均有差異，一旦標準曲線制定后，樣品的測定則必須與標準曲線制定的條件一致，否則結果有差異。
（二）紫外光譜吸收法
1．原理 本法根據蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光區的吸收特點而建立的。蛋白質在280nm波長附近有一吸收峰，其吸收程度與這些氨基酸的含量成正比。此法靈敏度高，可測到微克水平，操作簡單，不需要加各種試劑，測完后，樣品可回收。
2．標準曲線的制備
⑴ 用精密天平稱取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理鹽水中。
⑵ 以生理鹽水再稀釋成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以鹽水對照。
⑶ 測各管OD280 值。
⑷ 以OD280 值為縱坐標，蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線。