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表達蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析
點擊次數：1315 發布時間：2015-3-27
一、原理
細菌體中含有大量蛋白質，具有不同的電荷和分子量。強陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，通過加熱使蛋白質解離，大量的SDS結合蛋白質，使其帶相同密度的負電荷，在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上，不同蛋白質的遷移率僅取決于分子量。采用考馬斯亮蘭快速染色，可及時觀察電泳分離效果。因而根據預計表達蛋白的分子量，可篩選陽性表達的重組體。
二、試劑準備
1、30%儲備膠溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亞甲雙丙烯酰胺（Bis）1.0g，混勻后加ddH2O，37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室溫。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解,濃鹽酸調pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解,濃鹽酸調pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：電泳級SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,濃鹽酸調至pH 7.2,定容至100ml。
5、10′電泳緩沖液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解,定容至100ml。
6、10%過硫酸銨（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2′SDS電泳上樣緩沖液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，b-巰基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚蘭1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考馬斯亮蘭染色液：考馬斯亮蘭0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸46ml，ddH2O 225ml。
9、脫色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步驟
采用垂直式電泳槽裝置
（一）聚丙烯酰胺凝膠的配制
1、分離膠(10%)的配制:
ddH2O 4.0ml
30%儲備膠3.3ml
1.5M Tris-HCl2.5ml
10% SDS 0.1ml
10% AP 0.1ml
取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED 4μl ,混勻后灌入玻璃板間，以水封頂，注意使液面平。（凝膠*聚合需30-60min）
2、積層膠（4%）的配制：
ddH2O1.4 ml
30%儲備膠0.33 ml
1M Tris-HCl0.25 ml
10%SDS 0.02 ml
10%AP 0.02 ml
TEMED 2 μl
將分離膠上的水倒去,加入上述混合液,立即將梳子插入玻璃板間，*聚合需15-30min。
（二）樣品處理：將樣品加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃加熱3-5min，離心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同時將SDS低分子量蛋白標準品作平行處理。
（三）上樣: 取10μl誘導與未誘導的處理后的樣品加入樣品池中,并加入20μl低分子量蛋白標準品作對照。
（三）電泳:在電泳槽中加入1′電泳緩沖液，連接電源，負極在上，正極在下，電泳時，積層膠電壓60V,分離膠電壓100V,電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止（約需3hr）。
（四）染色:將膠從玻璃板中取出，考馬斯亮蘭染色液染色，室溫4-6hr。
（五）脫色:將膠從染色液中取出,放入脫色液中,多次脫色至蛋白帶清晰。
（六）凝膠攝像和保存：在圖像處理系統下將脫色好的凝膠攝像，結果存于軟盤中，凝膠可保存于雙蒸水中或7%乙酸溶液中。
三、注意事項
1、實驗組與對照組所加總蛋白含量要相等。
2、為達到較好的凝膠聚合效果，緩沖液的pH值要準確，10%AP在一周內使用。室溫較低時，TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經毒性，可通過皮膚和呼吸道吸收，應注意防護。