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一、實(shí)驗(yàn)技術(shù)及原理

運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)（體外擴(kuò)增后ACSs的表型會(huì)發(fā)生改變，主要體現(xiàn)在細(xì)胞表面蛋白和細(xì)胞因子表達(dá)的變化），差異離心術(shù)（可將基質(zhì)血管細(xì)胞沉淀與懸浮的成熟脂肪細(xì)胞分離，沉淀中除ASCs，還包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，基質(zhì)血管細(xì)胞沉淀可以接種到孰料培養(yǎng)瓶中，基質(zhì)細(xì)胞可貼壁，造血和其他雜質(zhì)細(xì)胞不貼壁，在隨后的傳代過程中被出去，zui終得到的ASCs可再很長時(shí)間內(nèi)保持摸分化狀態(tài)）。取C57BL／6 WT小鼠2只，常規(guī)麻醉消毒，取腹股溝脂肪組織剪碎至糊狀，PBS液沖洗去麻藥及血液，0.075%II型膠原酶消化（37℃，30分鐘）以去除外基質(zhì)，生理鹽水終止膠原酶的消化，離心（1 200 g，10分鐘），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重懸細(xì)胞沉淀，0.16 mol/L氯化氨溶解剩余紅細(xì)胞，離心洗滌，過200目銅網(wǎng)，得到單個(gè)核細(xì)胞。鏡下計(jì)數(shù)，按10⁴個(gè)細(xì)胞/ml種植在培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO₂孵箱培養(yǎng)，24小時(shí)后*次換液，以后3天換液一次，80%融合后0.25% Trypsin，0.02%EDTA消化傳代。細(xì)胞鏡下作形態(tài)學(xué)觀察及取第三代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀作細(xì)胞周期及細(xì)胞免疫表型（CD29/CD44）的鑒定。

二、實(shí)驗(yàn)用品

1.  材料：C57BL／6 WT小鼠。

2.  試劑：PBS液，0.075%II型膠原酶消化，10%FBS，低糖DMEM。

3.  儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、普通顯微鏡、倒置顯微鏡、離心機(jī)、離心管、解剖剪、眼科剪、鑷子（尖頭、平頭和有溝鑷）、小燒杯，200目銅網(wǎng)過濾器，低糖DMEM、血球計(jì)數(shù)板、橡皮瓶塞、酒精燈、換藥碗。

三、細(xì)胞培養(yǎng)的方法與步驟

1.  無菌操作的要領(lǐng)和要求。

2.  細(xì)胞原代培養(yǎng)

（1）操作步驟

a.  培養(yǎng)用品消毒后，安放在超凈工作臺(tái)內(nèi)，紫外線消毒，做好洗手等準(zhǔn)備工作。

b.  取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常規(guī)麻醉消毒，取腹股溝脂肪組織剪碎至糊狀，PBS液沖洗去麻藥及血液。

c.  消化：將漂洗后的組織至于平皿中,加入膠原酶（0.075%II型膠原酶, PH），用量（0.1-0.3 ug/ml或200 U/ml），再用移液管移至燒瓶中，置于37℃水浴或恒溫箱中30分鐘），每隔5-10 min振蕩一次。30 min后，生理鹽水終止膠原酶的消化。

d. 離心和計(jì)數(shù)：將離心管做好標(biāo)記，平衡后以（1 200 g，1 200 r/min 10分鐘），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重懸細(xì)胞沉淀，0.16 mol/L氯化氨溶解剩余紅細(xì)胞，將收集的細(xì)胞懸液經(jīng)200目銅網(wǎng)過濾，1 200 r/min 離心10分鐘（先后順序），得到單個(gè)核細(xì)胞。加入培養(yǎng)液吹打混勻后取樣計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁴個(gè)細(xì)胞/ml。

e.  接種培養(yǎng)：每10 cm²的培養(yǎng)瓶接種1 ml的細(xì)胞懸液，再添加4 ml的培養(yǎng)液，蓋緊瓶塞。標(biāo)上名稱、組號和日期，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞分散情況后，置于37℃ 5%CO₂孵箱培養(yǎng)。

（2） 觀察

每天對接種培養(yǎng)的細(xì)胞做常規(guī)性檢查。觀察的主要內(nèi)容：污染與否、細(xì)胞生長狀態(tài)和pH（培養(yǎng)液顏色變化）等情況。如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變?yōu)闄幟庶S色有渾濁，表明已被污染，細(xì)胞也就不易貼壁生長而逐漸死亡。如培養(yǎng)液顏色變?yōu)樽仙?，可能系培養(yǎng)瓶有裂口或瓶塞漏氣，CO2逸出或由于細(xì)胞生長不良有大量死亡。如培養(yǎng)液為橘紅色，一般說明細(xì)胞生長狀態(tài)良好。

在沒有發(fā)生污染，接種24h后，可見到許多細(xì)胞貼壁（由圓形懸浮狀態(tài)的細(xì)胞延展成短梭狀），24小時(shí)后*次換液，以后3天換液一次。培養(yǎng)3-4天時(shí)，細(xì)胞生長繁殖，細(xì)胞數(shù)量增加，并可見細(xì)胞形成孤立小片（細(xì)胞島），逐漸擴(kuò)展，細(xì)胞透明，顆粒啥，界線清晰。7-10天細(xì)胞已基本鋪滿瓶壁形成致密單層，（80%融合后）可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3.  細(xì)胞傳代培養(yǎng)

（1）操作步驟

a.  取一瓶脂肪干細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)細(xì)胞如長成致密的單層，即可進(jìn)行傳代。

b.  將培養(yǎng)瓶帶人超凈工作臺(tái)，倒去細(xì)胞培養(yǎng)液，吸取2ml-3ml PBS加入培養(yǎng)瓶中，輕輕振蕩后傾去，可重復(fù)進(jìn)行一次。

c.  加入5-8滴0.25% Trypsin，0.02%EDTA，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使其濕潤整個(gè)細(xì)胞層，置于室溫下笑話2-3 min。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細(xì)胞單層，見細(xì)胞單層薄膜上出現(xiàn)針孔大小空隙時(shí)即可倒去消化液。如見消化程度不夠時(shí)可再延長消化1-2 min。如見細(xì)胞大片脫落，表明已消化過頭，則不能倒去消化液而直接進(jìn)行下一步操作。

d.  加入3 ml培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中終止消化。吸取瓶中培養(yǎng)液反復(fù)沖瓶壁上的細(xì)胞層，直至瓶壁上的細(xì)胞全被沖下，再輕輕吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液。取樣計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁴個(gè)細(xì)胞/ml。吸取1 ml細(xì)胞懸液加到另一培養(yǎng)瓶中，原瓶留下1 ml細(xì)胞懸液，棄去多余懸液（可分別提取1 ml接種分配到多個(gè)培養(yǎng)瓶中），并向每瓶中加4 ml培養(yǎng)液。蓋好瓶蓋，標(biāo)上名稱、組號和日期，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞分散情況后，置于37℃ 5%CO₂孵箱培養(yǎng)。

（2）觀察

細(xì)胞傳代后，每天對細(xì)胞進(jìn)行觀察，注意污染與否、細(xì)胞貼壁和生長狀態(tài)等情況消化傳代。此過程中所做處理同原代培養(yǎng)。注意觀察細(xì)胞五個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)（游離期、吸附期、繁殖期、維持期、衰退期）。

細(xì)胞已基本鋪滿瓶壁形成致密單層，這時(shí)可進(jìn)行再次傳代培養(yǎng)。

四、細(xì)胞鏡下作形態(tài)學(xué)觀察及取第三代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀作細(xì)胞周期及細(xì)胞免疫表型（CD29/CD44）的鑒定

1.  在細(xì)胞鏡下作形態(tài)學(xué)觀察，與正常形態(tài)比較（原代培養(yǎng)后，傳代2-3次，ACSs呈現(xiàn)單層，大而扁的細(xì)胞形態(tài)，其直徑在25-30 um，待細(xì)胞達(dá)到匯合時(shí)，它們形態(tài)上呈紡錘形，類似于成纖維細(xì)胞）。

2.  細(xì)胞周期分析

分別取生長融合達(dá)30%-40%和90%以上的第三代細(xì)胞，以4°C預(yù)冷的70%冰乙醇固定，4°C放置24小時(shí)；用PBS洗滌2次；加入RNA酶10ug和碘化丙啶（PI）0.3ml重懸細(xì)胞（4°C，30分鐘）。用流式細(xì)胞儀以FL2紅色熒光條件檢測。應(yīng)用Modfit  LT  2.0 軟件分析細(xì)胞周期。

取第三代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀作細(xì)胞周期及細(xì)胞免疫表型（CD29/CD44）的鑒定。

3.  細(xì)胞表面分子免疫標(biāo)記的鑒定

a.  方法：直接免疫熒光法

b.  試劑及材料：單克隆抗體 CD29 PE，CD44  PE,及同型對照抗體；細(xì)胞洗液：含2%BSA、0.1%NaN3的PBS；固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH7.2）；流式細(xì)胞儀。

c.  操作方法：

每個(gè)樣品取2只，分別標(biāo)記同型抗體作為陰性對照、待測，分別加入10⁶ 個(gè)/100 ul待測細(xì)胞。對同型對照管中加入熒光標(biāo)記單克隆抗體 CD29 、CD44 對照抗體作為陰性對照，待測管加入熒光標(biāo)記單克隆抗體 CD29 PE，CD44 PE為實(shí)驗(yàn)管，各20 ul，混勻。置于于室溫避光孵育 30分鐘，加入2 ml 的PBS，1 200 r/min 離心 10 min，棄上清，控干，加入固定液0.5ml（染色緩沖劑）。先測同型對照，再測實(shí)驗(yàn)管。軟件采集數(shù)據(jù)，分析陽性細(xì)胞比例。

五、攜帶PTN表達(dá)基因的脂肪干細(xì)胞的獲取及鑒定

1.  實(shí)驗(yàn)技術(shù)及原理：運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將帶PTN基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染到脂肪干細(xì)胞，抗生素G418和流式細(xì)胞儀篩選，得到PTN高表達(dá)的脂肪干細(xì)胞。

2.  具體操作

（1）材料及試劑

（2） 脂肪干細(xì)胞的準(zhǔn)備：被用于作靶基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其生長狀態(tài)如何，將直接決定了基因轉(zhuǎn)染效率。如為貼壁生長的細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必需應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，細(xì)胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿的60%為宜，轉(zhuǎn)染當(dāng)日，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一將近新鮮培養(yǎng)液。對于懸浮細(xì)胞，也需在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液。

（3）將帶PTN基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染到脂肪干細(xì)胞，帶有PTN基因混合物應(yīng)當(dāng)逐滴加入，盡可能保持一致，從培養(yǎng)皿一邊到另一邊，邊加入邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。

（4）用抗生素G418和流式細(xì)胞儀篩選，得到PTN高表達(dá)的脂肪干細(xì)胞

G418篩選要做預(yù)試驗(yàn)確定*濃度，將細(xì)胞稀釋至1 000 cell/ml，每孔100 ul加入有培養(yǎng)基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0，100， 200，300， 400，500， 600，700， 800，900，1 000，1 100 ng/ml等１2個(gè)級別, 培養(yǎng)10-14天，以zui低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般400-800左右，篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級別，維持使用篩選濃度的一半。

流式細(xì)胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→單細(xì)胞懸液→70%酒精固定→裂解細(xì)胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機(jī)分析G1期和G2/M、S期比例。