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PCR產(chǎn)物的克隆技術(shù)
點擊次數(shù)：1543 發(fā)布時間：2014-7-23
在許多研究中,需要將PCR產(chǎn)物克隆,以獲得目的dna片段。此時,所用PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)盡量小,以減少平臺效應(yīng)或非特異性擴增產(chǎn)物的干擾。通常將PCR產(chǎn)物插入到載體中有下列一些方法。
1. 平末端連接：由于Taq dna聚合酶往往在PCR產(chǎn)物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產(chǎn)物前,可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶處理補平末端。
2. 在PCR產(chǎn)物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶會在3'端加上多余的非模板依賴堿基,而且對A優(yōu)先聚合,所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點,可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT,使載體與PCR產(chǎn)物末端互補并進行連接.載體末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3'端只加上一個ddTTP,而其5'端所含的磷酸基團可與PCR產(chǎn)物的3'端OH連接,連接產(chǎn)物在載體和PCR產(chǎn)物之間的雙鏈上帶兩個切口,這種重組DNA仍可轉(zhuǎn)化合適的受體菌,并在細(xì)菌體內(nèi)修復(fù).目前一些公司已開發(fā)出可直接用于克隆PCR產(chǎn)物的帶3'-T的T-Vector。
3. 粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點,直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA.如果下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點.經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。
第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑
一、材料
不同來源的模板DNA。
二、設(shè)備
移液器及吸頭，硅烷化的PCR小管，DNA擴增儀(PE公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設(shè)備(電泳槽及電泳儀)，臺式高速離心機。
三、試劑：
1、10×pcr反應(yīng)緩沖液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0% Triton X-100。
2、MgCl2 ：25mmol/L。
3、4種dNTP混合物:每種2.5mmol/L。
4、Taq DNA聚合酶5U/μl。
5、T4 DNA連接酶及連接緩沖液：配方見第五章。
6、經(jīng)SmaⅠ酶切和加dT的pUC質(zhì)粒。
7、其它試劑：礦物油(石蠟油)，1% 瓊脂糖，5×TBE，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇和70% 乙醇。
第三節(jié) 操作步驟
一、PCR反應(yīng)
1. 依次混勻下列試劑
35μl H2 O
5μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液
4μl 25mmol/L MgCl2
4μl 4種dNTP
0.5μl 上游引物(引物1)
0.5μl 下游引物(引物2)
0.5μl 模板DNA(約1ng)
混勻后離心5秒。
2. 將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷,迅速離心數(shù)秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心,加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。
3. 用94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘, 72℃延伸2分鐘, 循環(huán)35輪,進行PCR。zui后一輪循環(huán)結(jié)束后, 于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴增充分。
二、電泳
按第二章所述,取10μl擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析,檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度。
三、PCR產(chǎn)物的純化
擴增的PCR產(chǎn)物如利用T-Vector進行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化。
(一)酚/氯仿法
1.取反應(yīng)產(chǎn)物加100μl TE.。
2.加等體積氯仿混勻后用微型離心機10000rpm離心15秒,用移液器將上層水相吸至新的小管中. 這樣抽提一次, 可除去覆蓋在表面的礦物油。
3.再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次,每次回收上層水相。
4.在水相中加300μl 95%乙醇,置-20℃下30min沉淀。
5.在小離心機上10000rpm離心10min,吸凈上清液。加入1ml 70%乙醇,稍離后,吸凈上清液.重復(fù)洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7ml ddH2O 中，待用。
(二)Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)
Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)可以快速、有效、可靠地提取PCR擴增液中的DNA，提純后的DNA可用于測序、標(biāo)記、克隆等。
該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可供50次PCR產(chǎn)物的純化，試劑包括：
50ml Wizard PCR DNA純化樹脂
5ml 直接提取緩沖液
50支 Wizard微型柱
1、吸取PCR反應(yīng)液水相放于1.5ml eppendorf管中。
2、加100ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。
3、加1ml PCR DNA純化樹脂，1分鐘內(nèi)渦旋混合3次。
4、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。
5、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml 80%異丙 醇，對微型柱進行清洗。
6、取出微型柱置于eppendorf管中,12000g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。
7、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50μl TE或水，靜止1分鐘后，12000g離心20秒。
8、丟棄微型柱，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃。
[注意] 1、純化樹脂在使用前必須充分混勻。
2、PCR產(chǎn)物中礦物油應(yīng)盡量吸去，否則會影響提取DNA的 產(chǎn)量。
四、載體加dT尾
1.將1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2.在小管中按上述PCR反應(yīng),加入各種混合物,除將4μl 4種dNTP改為4μl 25mM dTTP。
3.加入1μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加熱2h。
4.按前面三中所述,用酚:氯仿:異戊醇抽提二次。
5.加入2倍體積 95%乙醇,在-20℃下沉淀1hr。
6、離心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
五、PCR產(chǎn)物與載體粘末端連接
1、在7ml PCR產(chǎn)物中加1ml帶dT尾的pUC質(zhì)粒。
2、加1ml T4DNA連接酶，1ml 10×連接緩中液，混勻，16℃連接。
3、取5ml連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組子。
六、PCR產(chǎn)物3'突出端切平及平末端連接
1. 在50ml的PCR產(chǎn)物中,直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混勻。
2. 37℃反應(yīng)10分鐘后,70℃滅活10分鐘。
3. 用酚:氯仿抽提2次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O中。
5. 質(zhì)粒用Smal 切開后，70℃ 15分鐘滅活酶，取1ml (約0.1mg)加入上述PCR產(chǎn)物中。加T4 DNA連接酶1ml ，連接緩沖液1ml 。
6. 取5ml 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組子。
[注意]1.PCR非常靈敏, 操作應(yīng)盡可能在無菌操作臺中進行。
2.吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌, 每次吸頭用畢應(yīng)更換, 不要互相污染試劑。
3.加試劑前, 應(yīng)短促離心10秒鐘, 然后再打開管蓋, 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。
4.應(yīng)設(shè)含除模板DNA所有其它成分的負(fù)對照。