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士鋒生物瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)技巧
點(diǎn)擊次數(shù)：1096 發(fā)布時(shí)間：2014-6-19
核酸分子是兩性解離分子，在高于其等電點(diǎn)的電泳緩沖液中，其堿基不解離，而磷酸基團(tuán)全部解離，核酸分子因而帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極遷移。瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取而來并經(jīng)糖基化修飾，為一種聚合鏈線性分子，使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì)，發(fā)揮分子篩功能，使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達(dá)到分離的目的。瓊脂糖凝膠電泳操作簡單、快速，通過調(diào)整其使用濃度，使得分辨率達(dá)到大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求，因此成為分離、鑒定、純化核酸分子的常用方法。但操作過程中仍有不少要注意的問題。
1 凝膠制作
1．1 凝膠濃度 配制凝膠的濃度據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而變 ，一般在0．8％ ～2．0％之間，如果一次配制凝膠100 ml，沒用完的凝膠可以再次融化，但隨著融化次數(shù)的增加，水分丟失也越多，凝膠濃度則會(huì)越來越高，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，補(bǔ)水辦法：一是在容器上標(biāo)記煮膠前的刻度，煮膠后補(bǔ)充相應(yīng)的水分至原刻度；二是在煮膠前稱重，煮膠后補(bǔ)充水至原重量。粗略一點(diǎn)的方法是通過多次較恒定的煮膠條件得出一個(gè)經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)水值。以保證凝膠濃度基本維持在原濃度。核酸染色劑溴化乙錠(ethidium bromide)可加在融化的瓊脂糖中，終濃度為0．5 t*g／ml；也可在電泳結(jié)束后染色。
1、2 梳板的選用 一般每個(gè)制膠模具均配有多個(gè)齒型不同的梳板，梳齒寬厚，形成的點(diǎn)樣孑L容積較大，用于DNA 片段回收實(shí)驗(yàn)等；相反，梳齒窄而薄，形成的點(diǎn)樣孑L容積就較小，用于PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物鑒定等。梳板的選擇主要是看上樣量的多少而定，一般來說，上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制膠，此時(shí)電泳條帶致密清晰，便于結(jié)果分析。另外，每次制膠時(shí)都要注意梳齒與底板的距離至少要1 mm，否則，拔梳板時(shí)易損壞凝膠孑L底層，導(dǎo)致點(diǎn)樣后樣品滲漏。當(dāng)然，點(diǎn)樣孑L的破壞還與拔梳板的時(shí)間和方法有關(guān)，一般凝膠需冷卻30 min以上方可拔梳板，應(yīng)急的情況下可以將成型的凝膠塊放4℃ 冰箱中冷卻15 min 左右，拔梳板的方法是將制膠槽放置在電泳槽中的電泳緩沖液中，然后垂直向上慢慢用力，因?yàn)橛幸后w的潤滑作用，梳板易拔出且不易損壞點(diǎn)樣孑L。
2 點(diǎn)樣
點(diǎn)樣需加上樣緩沖液，因?yàn)樯蠘泳彌_液中加了甘油或蔗糖增加密度，使樣品沉入孑L底；指示樣品的遷移過程，上樣緩沖液中一般加了兩種指示劑，溴酚蘭和二甲苯青(值得注意的是指示劑并非染色劑，DNA染色劑是溴化乙錠，而且要在紫外光的激發(fā)下才能看見桔紅色熒光)。上樣緩沖液儲(chǔ)存液一般為6× (10×)，表示其濃度為工作濃度的六倍。使用時(shí)上樣緩沖液應(yīng)稀釋到一倍濃度。點(diǎn)樣方法是將移液器基本垂直點(diǎn)樣孑L，用另一只手幫助固定移液器下端，移液器槍頭(Tip)進(jìn)入點(diǎn)樣孑L即可將樣品注入孑L內(nèi)，千萬不可將Tip尖插至孑L底，并點(diǎn)上適合的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，所謂適合是指樣品DNA分子量大小應(yīng)基本在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)。
3 電泳
將電泳儀的正極與電泳槽的正極相連，負(fù)極與負(fù)極相連，核酸帶負(fù)電荷，從負(fù)極向正極移動(dòng)。電泳槽中電泳緩沖液與制膠用電泳緩沖液應(yīng)相同，電泳緩沖液剛好沒過凝膠1 mm 為好，電泳緩沖液太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。電泳時(shí)凝膠上所加電壓一般不超過5 v／cm(指的是正負(fù)電極之間的距離，而不是凝膠的長度)，電泳時(shí)間一般為3O～60 min，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要也可作適當(dāng)調(diào)整，電壓增高，電泳時(shí)間縮短，核酸條帶相對來說不夠整齊，不夠清晰；相反，電壓降低，電泳時(shí)間較長，核酸條帶整齊清晰。另外，如果電泳后樣品泳動(dòng)很慢或者沒泳動(dòng)，請檢查膠模兩端的封口膠條是否已去掉。
4 結(jié)果分析
較成功的電泳結(jié)果是分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶整齊清晰，樣品條帶也整齊清晰，如果條帶模糊暗淡，單從瓊脂糖凝膠電泳角度來說，可能的原因：溴化乙錠的質(zhì)和量怎樣?溴化乙錠見光易分解，母液配制時(shí)間過長或保存不當(dāng)(一般4℃ 避光保存一年內(nèi)有效)，或者終濃度沒達(dá)到0．5 vg／ml；電泳槽中緩沖液使用次數(shù)過多，緩沖能力下降。特別是TAE緩沖液，一般用2～3次就要更換，TBE緩沖液則可使用10次左右。
實(shí)際工作中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)小片段模糊不清，那足因?yàn)榄傊悄z濃度一般不會(huì)超過2 0％ ，較小的核酸片段 在它的分辨范圍之內(nèi)，并且EB帶正電荷，電泳時(shí)會(huì)向負(fù)傲移動(dòng)，如果將凝膠置含EB(0．5#g／m1)的水溶液中30 min，較小的片段則可重新染色：另外，溴化乙錠(EB)是一種中等強(qiáng)度誘變劑，操作過程中要戴手套，并將加有EB的染色液作好標(biāo)記、妥善保存 。。