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士鋒生物電泳、轉膜
點擊次數：929 發布時間：2014-5-7
轉膜是把DNA從瓊脂糖凝膠中轉移到固相支持物（一般是尼龍膜）上固定，是進行各種后續研究（如RFLP分析，陽性克隆的篩選驗證等所有涉及分子雜交的研究）的前提。
實驗目的：掌握Southern Blotting的原理及操作步驟
實驗原理：
1. 轉膜的方式：
向上的毛細管轉移
向下的毛細管轉移
同時向兩張膜轉移
電轉移
真空轉移
2. 固相支持物的種類及選擇：
硝酸纖維素膜：非共價結合，易脆，易丟失DNA，< 500 bp的DNA無效，轉膜前的工作（從提高轉膜效率，利于轉膜后使用等）
尼龍膜（帶正電荷的）高強度，不易破損，具有較大的DNA結合容量，它能夠吸附變性DNA，核酸以共價結合方式不可逆的結合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有同樣吸附DNA功能，無論用哪邊均可以經久耐用，可反復利用10次以上（10-20次），經毛細管（毛細吸附）作用，把DNA從凝膠上轉到膜上。DNA轉到膜上是復制膠上的帶型，在80-100℃真空干燥2-4 hrs，即可固定DNA。
3. 轉移緩沖液（transfer buffer）的選擇：
帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強度（SSC），但不能充分發揮膜潛能；0.4N NaOH，共價結合DNA是zui大優點。
硝酸纖維膜：高鹽離子強度促進DNA與膜結合（20×SSC），低鹽離子強度導致小片段DNA在轉移過程中丟失，pH>9，DNA不能與膜結合。
4．轉膜時間（duration of transfer）約12 hrs
效率高低，但已無補救措施，因此，每一步應嚴格操作。
實驗材料及試劑：酶消化好的DNA樣品，尼龍膜，0.2N HCl，0.4N NaOH等
實驗步驟：
1． 0.8%瓊脂糖電泳
制膠：注意瓊脂糖的質量，膠的濃度，厚度（<5mm）及均一性。一般大電泳槽配制250ml 0.8%瓊脂糖凝膠，采用42孔梳子（經濟，）
制樣，點樣：DNA樣品中指示劑量稍多
電泳：一般1-1.5V/cm的電壓， 使DNA遷移到適當距離，一般指示劑約移動10-11cm (大電泳槽：40V×12-15hrs，小電泳槽30V×4-5 hrs)
2．轉膜前的準備：
依膠大小每塊凝膠準備兩張比膠稍大的濾紙（11×12.5 cm），兩張用作鹽橋的濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜（10×10.5cm），兩個玻璃盤、兩塊有機玻璃板、一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。
3．一玻璃盤中加入足量的0.4N NaOH，放上洗凈的玻璃板，按圖示搭制鹽橋(操作示范)。
4．凝膠的預處理:
a) 從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當大小，切去右上角（zui后一個樣品的zui前端）作為電泳方向記號
b) 把凝膠翻面，放入加有足量的0.2N HCl玻璃盤中，輕輕搖動10min，使指示劑變黃色為止（脫嘌呤）
c) 倒去HCl溶液，加蒸餾水漂洗凝膠
d) 倒去蒸餾水，加0.4N NaOH中和
e) 同時在鹽橋濾紙上灑些0.4 NaOH，立即將膠放在鹽橋上（忌氣泡）
5．膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（吸水紙與鹽橋相接）
6．在膠面上倒足夠量0.4N NaOH，小心放置膜（預濕0.4N NaOH）使膜覆蓋整塊膠（要求一次成功，不能移動）
7．膜上放2張濾紙，濾紙大小為15×12cm
8．放不少于5cm厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約500g的重物，轉膜12 hrs左右
9．轉膜完畢，用2×SSC漂洗膜兩次，各五分鐘。用EB染膠以檢測轉移效果。
10．用兩張濾紙包住膜，置于80-100℃的真空干燥箱中，干燥2-4 hrs。