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士鋒生物細菌總DNA的提取和鑒定實驗介紹
點擊次數(shù)：1483 發(fā)布時間：2014-2-21
(一)試劑：
菌株(E.coli );蛋白酶k(20mg/ml);瓊脂糖;標準DNA水解液
1.10%SDS
2.酚/氯仿/異戊醇(1/1/1)
3.異丙醇;70%乙醇
4.LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g加蒸餾水至1升，然后滅菌備用。
5.TE緩沖液：10mM Tris• HCl,0.1mM EDTA (pH8.0)。
6. CTAB/NaCl溶液(5% w/v)：5g CTAB 溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需要加熱到65℃使之溶解，然后室溫保存。
7.TAE緩沖液(50×)(pH8.0)：每升溶液中含有242g Tris,57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA。電泳時稀釋成1× 濃度使用。
8.溴酚蘭-甘油指示劑：先配制0.1%溴酚蘭水溶液，然后取1份0.1%溴酚蘭溶液與等體積的甘油混合即成
9.0.5μg/ml 溴乙啶染液：稱取5mg溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml,取1ml此溶液用1xTAE緩沖液稀釋到1升，zui終濃度為0.5μg/ml。
(二)器材：
錐形瓶(250ml)，1.5ml 離心管，水浴鍋，離心機，電泳槽，電泳儀，搖床，移液槍，潔凈工作臺，電磁爐，紫外成像儀
【實驗方法】
(一)細菌總DNA的提取
1.將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)。
2.取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。
3.沉淀物加入567μl的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30μl 10%SDS和15μl的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h.
4.加入100μl 5mol/L NaCl,充分混勻，再加入80μl CTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10min。
5.加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。
6.沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇，在潔凈工作臺中稍加干燥，重溶于20μl TE緩沖液(含RNaseA-25ng/ml)中，準備電泳檢測。
(二)瓊脂糖凝膠電泳
1.制膠：稱取瓊脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE緩沖液配成0.8%的濃度，加熱使瓊脂糖全部融化于緩沖液中，待溶液溫度降至65℃時，立即倒入制膠槽中，插入樣品梳。在室溫放置0.5-1h，待凝膠全部凝結(jié)后，輕輕拔出樣品梳。然后在電泳槽中加入電泳緩沖液直到?jīng)]過凝膠為止。
2.加樣：取0.5-1μg 左右的樣品，體積為10-20μl，加入1/4體積的溴酚蘭-甘油指示劑，混勻后小心地加到樣品槽中。同時另取一個已知分子量的標準DNA水解液，在同一凝膠板上進行電泳。
3.電泳：維持恒壓100V，電泳0.5-1h，直到溴酚蘭指示劑移動到凝膠底部，停止電泳。
4.染色：
將凝膠取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.5-1h。染液可反復(fù)多次使用。
5.觀察：
將凝膠板置于254nm波長紫外燈下進行觀察。DNA存在的位置呈現(xiàn)橙黃色熒光。
【注意事項】
1.溴乙啶有毒，配制和使用溶液時要戴手套，勿將溶液滴灑在臺面或地面上。溴乙啶溶液于室溫保存在棕色瓶中。
2.倒凝膠板時不要太厚，否則影響電泳效果。