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士鋒生物引物退火溫度設(shè)計技巧
點擊次數(shù)：992 發(fā)布時間：2014-2-14
PCR引物設(shè)計中的一個重要參數(shù)即是熔解溫度(Tm)。這是當50%的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定pcr退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。
有幾種公式。表4列出確定引物Tmzui常用的兩種方法。*個公式來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。第二個公式根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。
用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得*結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比zui低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。