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士鋒生物聚丙烯酰胺凝膠（PAGE膠電泳）電泳的方法與銀染方法
點擊次數：1463 發布時間：2014-2-13
PAGE膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳）主要是以PAGE為介質，根據DNA分子大小和電荷分離DNA分子。PAGE膠電泳采用銀染法進行顯色。銀染的原理：一、銀離子（一般是AgNO3)和DNA結合;二、還原劑甲醛把Ag+還原成銀顆粒，zui終DNA呈現為黑褐色。
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的電泳方法。在這種支持介質上可根據被分離物質分子大小和分子電荷多少來分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質、小于1Kb的DNA段和DNA序列分析，其裝載的樣品量大，回收DNA純度高，長度僅相差0.1%(即1000bp中的1bp)的核苷酸分子即能分離。
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯劑，N，N'一亞甲雙丙烯酰胺(交聯劑)參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯接而形成凝膠。聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺和交聯劑的濃度及比例決定的，不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍見下表.
丙烯酰胺(%) 有效分離范圍(bp) 溴酚蘭* 二甲苯青*
3.5 100～2000 100 460
5.0 80～500 65 260
8.0 60～400 45 160
12.0 40～200 30 70
15.0 25～150 15 60
20.0 10～100 12 45
*表中給出的數字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對數目(bp)。
一 器材及試劑
1.電泳儀，垂直電泳槽及其附件，玻璃板，常用實驗器材等。
2.玻璃板處理試劑：
(1) KOH/甲醇溶液：5gKOH溶于100ml甲醇中，用于清洗玻璃板。
(2) 95%乙醇
(3) 親和硅烷溶液：95%乙醇 4ml
冰乙酸 20ul
親和硅烷 20ul
(4) 玻璃硅烷：用移液器取適量于短板上，用無塵擦拭紙涂抹均勻。
2.丙烯酰胺溶液45%
丙烯酰胺：43.4克
N，N'一亞甲基雙丙烯酰胺：1.6克
H2O，加至100ml
裝于棕色瓶內，4℃可保存二個月。
3.變性劑尿素0.7g/ml：稱取175g溶于125ml左右水中，定容到250ml。
4.過硫酸銨0.1g/ml：稱取過硫酰銨1g加水至10ml。4℃可保存一周，-20℃可保存一個月。
5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和過硫酸銨一起作為交聯反應的催化劑。易吸潮，4℃封閉保存。
6.1XTBE電泳緩沖液
TBE電泳母液(5×)的配制
1)分別稱取54克Tris堿，27.5克硼酸，20ml 0.5mol/EDTA(PH=8.0)
2)將各組分別加入1升燒杯中，用ddH2O定容到1升。
3)在電泳時使用1倍工作液，按1：4與水混合。
4)1倍液是為了增加電泳工作液的電流的電流量。
5)盛于玻璃瓶，在室溫保存。
使用同樣的TBE配制膠和電泳液，因為兩者間微小的差異就會導致DNA扭曲。
7.上樣緩沖液:含有變性劑
8..超純水及滅菌的超純水
二 聚丙烯酰胺凝膠的制備
根據分離DNA段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠.
1.玻璃板處理：KOH/甲醇溶液或KOH溶液浸泡玻璃板一定時間，用去污劑和清水清洗干凈，zui后用雙蒸水沖洗兩遍。自然晾干。用95%乙醇擦拭長短板。長短板分別用親和硅烷和玻璃硅烷均勻擦拭。5-10分鐘后再用95%乙醇擦拭長短板。
2.固定玻璃板：處理面向上，把兩個封條分別置于兩側，把梳子置于長板一端的兩封條間。短板處理面向下蓋到長板上，用夾子固定，再用膠帶封閉除放有梳子一端外的其它三邊縫，防止漏膠。把固定好的玻璃板長向傾斜適當角度(300)，短向傾斜角度(200-300)
3.配制膠溶液(5%)： 原膠： 8.34ml
尿素： 45ml
5xTBE： 15ml
雙蒸水：6.66ml
TEMED: 30-36ul
ASP： 240ul
注：由于尿素在室溫難溶解，故在配制膠時應提前把尿素溶液置于55℃水浴中預熱，是尿素*溶解。
4.灌膠：把梳子取出，用注射器取大約50ml的膠溶液，緩緩地使膠溶液注入兩板間，等膠溶液快要溢出時，把玻璃板放平，倒插梳子，用夾子夾緊使梳子和玻璃博間沒有縫隙從而防止點樣時串樣，整個過程不要產生氣泡。
5.凝固：灌完膠后，放于室溫讓其自然凝固，觀察膠邊沿出現折射線就表明膠以凝固。凝膠可立即使用，或保存于室溫24小時，4℃48小時。
三 聚丙烯酰胺凝膠電泳
1.固定玻璃板于電泳儀：取掉玻璃板上的夾子，撕掉膠帶，用清水沖洗干凈玻璃板，短板向里固定于電泳儀支架上，即凹口板面向電泳液。
2.預電泳：取5xTBE200ml稀釋到1000ml制成1xTBE。向電泳儀下端槽內倒1xTBE約500ml，向上槽倒1xTBE，使液面高于短板上沿。拔出梳子，并用注射器吸取適量電泳液把點樣孔洗干凈(因為梳子取出后，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會流入加樣孔內聚合，產生不規則的表面，將導致以后DNA電泳帶型不規則)。
打開變壓器，調節電壓為80W，預電泳30min。
3.電泳:
1)上樣：插入梳子，在預電泳期間把選擇性擴增產物94℃變性10min后，迅速置于冰上冷卻。向選擇性擴增產物中按2：1的比例加上樣緩沖液并混勻，取5-6ul上樣。
2)調節電壓60W，電泳2小時左右。根據指示劑遷移位置來判定是否終止電泳。電泳完畢，關掉電泳儀。取下玻璃板，用冰袋冷卻，準備顯色。
聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出>10ng以上量的DNA條帶.要求更高的靈敏度，可用銀染。
四 聚丙烯酰胺凝膠電泳的顯色----銀染
銀染的原理：銀離子和DNA結合，還原劑甲醛把銀離子還原成銀顆粒，使DNA條帶呈黑褐色而顯現出來。其靈敏度比EB高200倍，但銀染色后，DNA不宜回收。
1.固定：固定液 冰醋酸： 150ml(10%)
雙蒸水：1350ml
把經冷卻的膠板置于盛有1.5L的塑料盤中，搖床震蕩30min左右。
2.洗膠：把經固定的膠板置于盛有1.5L雙蒸水的塑料盤中清洗兩次，每次2-4min。
3.染色： 染色液 硝酸銀： 1.5g(0.1%)
37%甲醇：2.25ml
加雙蒸水至1.5L
把清洗干凈的膠板置于盛有染色液的塑料盤中，搖床震蕩30min左右。
4.洗膠：把經固定的膠板置于盛有1.5L雙蒸水的塑料盤中清洗一次，該步驟動作要迅速，約3s。
5.顯色：顯色液 碳酸鈉： 45g(0.03g/ml)
37%甲醛： 2.25ml(0.15%)
硫代硫酸鈉：300ul(10mg/ml)
加雙蒸水至1.5L
把清洗干凈的膠板置于盛有顯色液的塑料盤中顯色。顯色時間根據條帶和背景顏色深淺調整，達到DNA條帶清晰的目的。顯色液一定要預冷至4-10，否則會使被背景加深。
6.終止顯色：把染色完畢的膠板放回盛有固定液的塑料盤中，反應3min。用雙蒸水清洗兩次(每次2min)。
7.干膠：膠板置于室溫自然干燥。
8.條帶統計。
注：1.固定時間可以減少，只要指示劑顏色消失即可
2.提高硝酸銀濃度(0.2%)，可減少染色時間。
注意事項：PAGE膠電泳，采用銀染法顯色后，雖然其靈敏度比EB高很多，但是這種方法不利于DNA回收。