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士鋒生物免疫共沉淀原理及試劑配制方法
點擊次數：1058 發布時間：2014-1-16
一 原理：
IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的“prorein A"特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法。目前多用精制的prorein A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。
實驗zui需要注意點就是抗體的性質。抗體不同和抗原結合能力也不同，免染能結合未必能用在IP反應。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。
其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質。多數的抗原是細胞構成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果。
再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進行實驗。
每次實驗之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。欲速則不達，確定好比例很必要。
二 準備：
器械
微量高速冷凍離心機
移液槍
旋轉盤
電泳設備
vortex震蕩器
液氮及組織粉碎器
試劑
細胞或組織
蛋白定量kit
SDS電泳試劑
抗體(單抗時選擇protein G,二抗選擇抗鼠Ig兔血清)
PBS
NaN3
proteinA sapharose
試劑配制
抗原蛋白溶解緩沖液
1.RIPA緩沖液 (zui終濃度)
1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
5MNacl 15ml (150mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
20%TritonX-100 25ml (1%)
10% DOC 50ml (1%)
10%SDS 5ml ( o.1%)
TLCK 18.5mg (0.1mM)
TPCK 35mg (0.2mM)
DDW 395ml
toal 500ml
另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，濃度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水)