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血清IgG的分離制備—鹽析法
點擊次數：1323 發布時間：2013-12-24
（一）原理
IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，簡稱IgG）的主要成分之一，分子量約為15萬~16萬，沉降生活費數約為7s。IgG是動物和人體血漿的重要成分之一。血漿蛋白質的成分多達70余種，要從血漿中分離出IgG，首先要進行盡可能除去其他蛋白質成分的粗分離程序，使IgG在樣品中比例大為增高，然后再純化而獲得IgG。
鹽析法是粗分離蛋白質的重要方法之一。許多蛋白質在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無機鹽則溶解度增加，這種現象稱為“鹽溶"（Salting in）。而當鹽濃度繼續增加到某一濃度時，蛋白質又變得不深而自動析出，這種現象稱為“鹽析‘（Salting out）。這些現象的原理大致是由于蛋白質是親水膠體，帶有羧基解離的負電荷或氨基解離的正電荷，其極性基團使分子間相互排斥，同時與水分子形成水膜，這些因素保證蛋白質形成溶于水的溶膠狀態。當加入少量鹽時，增多了蛋白質分子上的極性基團，因而增大了蛋白質在水中溶解度，出現“鹽溶"現象。鉭當鹽濃度增加到一定濃度時，一方面大量的水同鹽分子結合，使得蛋白質沒有足夠的水維持溶解狀態，破壞了維持蛋白質親水膠的水膜，容易沉淀出來；另一方面加入的鹽離子中和了蛋白質分子相互磁撞時即發生相互聚集沉淀出來，這樣就出現了“鹽析"現象。由于各種蛋白質“鹽析"出來所需的鹽濃度也各異，鹽析所需的zui小鹽量稱做鹽析濃度。鹽析法就是通過控制鹽的濃度，使蛋白質混合溶液中的各個成分分步“鹽析"出來，達到分離目的蛋白質。
鹽析法是1878年Hammarster使用的，他用硫酸鎂成功地將血清蛋白分成為清蛋白、球蛋白兩部分。自那以后曾使用過硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽來鹽析蛋白質，其中運用zui廣的是硫酸銨。因為硫酸銨有許多其他鹽所不具備的優點，如在水中化學性質穩定；溶解度大，25℃時能達到4.1mol/L的濃度；溶解度的溫度系數變化較小，在0~30℃范圍內溶解度變化不大，如25℃時飽和溶解度為4.12mol/L，即767g/L，0℃時飽和溶解度為3.9mol/L，即676g/L。而且硫酸銨價廉易得，分段效果比其他鹽好，性質溫和，即使濃度很高時也不會影響蛋白質的生物學活性。因此，現在所指的鹽析法實際上多為硫酸銨鹽析法。
用硫酸銨分級鹽析蛋白質時，鹽析出某種蛋白質成分所需的硫酸銨濃度一般以飽和度來表示。實際工作中將飽和硫酸銨溶液的飽和度定為100%或1。鹽析某種蛋白質成分所需的硫酸銨數量折算成100%或1飽和度的百分之幾，即秒為該蛋白鹽析的飽和度。飽和度可以根據情況用下述兩種方法計算。
1．飽和硫酸銨溶液法 在蛋白質溶液的總體不大，要求達到飽和度在50%以下時，可選用此方法。在已知鹽析出某各蛋白質成分所要過到飽和度時，可按下列公式計算出應加入飽和硫酸銨溶液的數量：
血清IgG的分離制備—鹽析法
式中：
V0——蛋白質溶液的原始體積；
C2——所要達到硫酸銨飽和度；
C1——原來溶液的硫酸銨飽和度；
V——應加入飽和硫酸銨溶液的體積。
將計算所得體積的飽和硫酸銨溶液加入到混合蛋白質溶液中，即可達到鹽析的目的。嚴格講，混合兩不同溶液時，混合后的總體積并不等于混合前兩種溶液體積之和，而上式中是按相等于計算的，所以會產生誤差。但實驗證明所造成的誤差一般小于20%，故可忽略不計。
2．固體硫酸銨法 所需達到的飽和度較高，而蛋白質溶液的體積又不能再過分增大時，采用直接加入固體硫酸銨的方法。欲達到某到飽和度可按下列公式計算出應加入固體硫酸銨的數量：