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士鋒生物免疫印跡法
點擊次數：1135 發布時間：2013-12-2
次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區帶染色。常用的HRP底物為3，3’-二氨基聯苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍紫色）。陽性反應的條帶清晰可辨，并可根據SDS-PAGE時加入的分子量標準，確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個有效的分析手段，不僅廣泛應用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗。抗原經電泳轉移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標抗體及顯色底物制成的試劑盒，可方便地在實驗室中供檢測用。根據出現顯色線條的位置可判斷有無針對病毒的特異性抗體。
一． SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
基本原理是聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體acr聚合成長鏈并通過雙功能化合物甲叉雙丙烯酰胺Bis交聯而成的三維網狀結構凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的機械性、彈性、透明度、粘著度取決于凝膠的總濃度，總濃度越大，平均孔徑越小，機械強度越強。T是Acr與Bis的總百分濃度，C是Acr：Bis的重量百分比，T恒定，C為4%時，有效孔徑zui小，C大于或小于4%時，有效孔徑均變大；C恒定，T增加，有效孔徑降低。聚合過程由TEMED（四甲基乙二胺）和過硫酸銨激發。
陰離子去垢劑SDS能破壞蛋白質中的氫鍵和疏水鍵，按一定比例和蛋白質分子結合成復合物，使蛋白質帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷量，掩蓋了各種蛋白質分子間的天然電荷差異；加入巰基乙醇使電泳的遷移率不再愛原有分子形狀的影響。蛋白質的遷移率將主要取決于其分子量的大小
基本步驟：
1.收集蛋白樣品（Protein sample preparation）
可以使用適當的裂解液，裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等，用SDS上樣緩沖液，裂解能力強，能提取細胞總蛋白，可用來檢測多種蛋白，包括磷酸化蛋白。另外，常用的還有非離子去垢劑緩沖液裂解法，低滲緩沖液裂解法。可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進行抽提.
2.蛋白質濃度測定：
收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同，需要采用適當的蛋白濃度測定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。更方便的方法是選用成套的裂解液和定量試劑盒測定蛋白質。如果濃度過高，可按比例稀釋，讀出蛋白濃度后，再折算回原樣品濃度。
3. 電泳（Electrophoresis）
配制SDS-PAGE凝膠，在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。
注意：Acr和Bis單體對神經系統和皮膚有毒性作用，TEMED對粘膜和上呼吸道組織及皮膚有很大的破壞作用
4．電泳結果檢查：
如果要做Western Blot，是否需要先檢查電泳結果呢？能先看看結果如何再進行下一步轉膜當然。考馬斯亮藍使用簡便快速，可以分辨1ug左右的條帶，是通用的蛋白PAGE膠電泳染色方法。銀染操作復雜一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。可是由于考馬斯亮藍染色或者銀染經過固定不可逆結合，會干擾后面的Western Blot實驗，很多人會選擇省略掉這一步——同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉膜，一般也可以說明問題。如果想在轉膜前看看電泳結果，你需要用SYPRO Tangerine——這種金色熒光蛋白染料靈敏度很高——檢測4ng-8ng蛋白，接近銀染，但使用非常簡單，zui重要的是由于不用酸堿或者有機溶劑固定，不干擾蛋白活性，特別適合Western轉膜前的染色，或者非變性膠的活性蛋白的檢測（比如染色后還需要在膠上進行活性檢測等等）。可惜SYPRO Tangerine價格挺貴的，500ul（5000x）要2000元，即使很節約的用只夠大概100多次呢。所以實惠的方法是：麗春紅S，直接染色轉移膜，檢測轉膜效果，充分脫色后不干擾Western結果。麗春紅的檢測靈敏度和考馬斯亮藍差不多。