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士鋒生物蛋白質的等電點測定和沉淀反應實驗步驟和注意事項
點擊次數：8319 發布時間：2013-11-8
士鋒生物蛋白質等電點的測定
1、 目的：了解蛋白質的兩性解離性質;學習測定蛋白質等電點的一種方法。
2、原理：蛋白質是兩性電解質，蛋白質分子的解離狀態和解離程度受溶液酸堿度影響。當溶液的PH達到一定的數值時，蛋白質顆粒上正負電荷的數目相等，在電場中，蛋白質既不向陰極移動也不向陽極移動，此時溶液的PH值稱為此種蛋白的等電點。不同的蛋白質的等電點各不相同。在等電點時，蛋白質的理化性質都有變化，可利用此種性質的變化測定各種蛋白質的等電點。
3、材料與試劑
0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液 200ml（取0.8g酪蛋白，加少量水在乳缽中仔細研磨，將所得的蛋白質懸膠液移入200ml的錐形瓶中，用少量40-50℃的溫水洗滌乳缽，將洗滌液也移入錐形瓶內。加入10ml1M醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋轉錐形瓶，直到酪蛋白*溶解為止。將錐形瓶內的溶液全部移至200ml的容量瓶內，加水至刻度，定容。1.00M醋酸溶液 100ml;0.10M醋酸溶液 100ml;0.01M醋酸溶液
4、儀器
水浴鍋、溫度計、200ml錐形瓶、100ml容量瓶、吸管（1ml、10ml）、試管、試管架、乳缽
5、操作
（1）取相同規格的試管4支，按下表順序分別地加入各試劑
| 試管號 | 蒸餾水（ml） | 0.01M醋酸（ml） | 0.1M醋酸（ml） | 1.0M醋酸（ml） |
| 1 | 8.4 | 0.6 | － | － |
| 2 | 8.7 | － | 0.3 | － |
| 3 | 8.0 | － | 1.0 | － |
| 4 | 7.4 | － | － |
| 1.6 |
（2）向以上試管中各加入酪蛋白的醋酸鈉溶液1ml，加一管，搖勻一管。此時1、2、3、4管的PH依次為5.9、5.3、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。zui混濁的一管的PH即為酪蛋白的等電點。
二、蛋白質的沉淀及變性
1、目的：加深對蛋白質膠體溶液穩定因素的認識;了解沉淀蛋白質的幾種方法及其實用意義;了解蛋白質扁形與沉淀的關系。
2、原理：在水溶液中的蛋白質分子由于表面生成水化層和雙電離層而成為穩定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質的沉淀反應可分為兩類：（1）可逆的沉淀反應：如蛋白質的鹽析作用和在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質。提純蛋白質時常用。（蛋白質分子的結構尚未發生顯著變化）;（2）不可逆沉淀反應：如加熱引起的蛋白質沉淀與凝固或與重金屬或有機酸的反應（蛋白質分子內部結構發生重大改變）。蛋白質變性后，有時維持溶液穩定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質并不一定都表現為沉淀，而沉淀的蛋白質也未必都已變性。
3、材料與試劑
蛋白質溶液 500ml（5%卵清蛋白溶液或雞蛋蛋清的水溶液 新鮮雞蛋蛋清：水=1：9）PH4.7醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液 100ml;3%硝酸銀溶液 10ml;5%溶液 50ml;95%乙醇 250ml;飽和硫酸銨溶液 250ml;硫酸銨結晶粉末 1000g;0.1M鹽酸溶液 300ml;0.1M氫氧化鈉溶液 100ml;0.05M碳酸鈉溶液 100ml;0.1M醋酸溶液 100ml;甲基紅溶液 20ml;2%氯化鋇溶液 150ml
4、操作
（1）蛋白質的鹽析：無機鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液能析出蛋白質。鹽的濃度不同，析出的蛋白質也不同。加5%卵清蛋白溶液5ml于試管中，再加等兩的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么?將管內容物過濾，向管內添加硫酸銨粉末到不溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。
（2）重金屬離子沉淀蛋白質：重金屬離子與蛋白質結合生成不溶于水的復合物。取1支試管，加入蛋白質溶液2ml，再加3%硝酸銀溶液1-2滴，振蕩試管，有沉淀產生。放置片刻，傾去上清夜，向沉淀中加入少量水，觀察現象解釋原因。
（3）某些有機酸沉淀蛋白質：取1支試管，加入蛋白質溶液2ml,再加入1ml5%溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清夜，向沉淀中加水觀察現象，解釋原因。
（4）有機溶劑沉淀蛋白質：取1支試管，加入2ml蛋白質溶液，再加入2ml95%乙醇。混勻，觀察現象。加水再觀察解釋原因。
（5）乙醇引起的變性與沉淀：取3支試管，編號。依下表順序加入試劑：
| 5％卵清蛋白溶液 | 0.1M氫氧化鈉 | 0.1M鹽酸 | 95％乙醇 | PH4.7緩沖溶液 | |
| 1 | 1 | － | － | 1 |
| 1 |
振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內加入8ml水，然后在第2、3號管中各加入一滴甲基紅，再分別用0.1M醋酸溶液及0.05M碳酸鈉溶液中和之。觀察各管顏色的變化何沉淀的生成。每管再加0.1M鹽酸溶液數滴，觀察沉淀的再溶解。解釋原因。