QQ交談
您所在位置：請輸入產品關鍵字：
郵編：200431
聯系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機：13122441390 15900755943
留言：發送留言
個性化：www.shifengsj.com
網址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://www.js967.com/st236594/
士鋒生物DNA的連接策略
點擊次數：910 發布時間：2013-10-13
4.1.1 DNA的連接策略
質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的dna段（<10kb）且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA段，然后體外使兩者相連接，再用所得到重組質粒轉化細菌，即可完成。
外源DNA段和質粒載體的連接反應策略有以下幾種：
（1）互補性粘性末端的連接
單一限制性內切酶或兩種限制性內切酶（為同尾酶，如BamHI和BglII）分別處理載體和外源DNA，得到的粘性末端為互補性突出末端，在連接反應中外源片段和質粒載體DNA均可能發生自身環化或幾個分子串連形成寡聚物，且正反兩種連接方向都可能有。為了降低載體的自身環化，使正確的連接產物數量達到zui高水平，一般載體DNA和外源DNA的分子數比（濃度比）為1：3～1：10之間。同時，為了zui大限度地抑制質粒DNA的自身環化，還可將載體DNA的5’磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉，防止其自身環化。而帶5’端磷酸的外源DNA段可有效地與去磷酸化的載體相連，產生一個帶有兩個缺口的開環分子，在轉入E.coli受體菌后該種缺口可在DNA復制過程種自動修復。
（2）非互補粘性末端的連接
用兩種不同的限制性內切酶進行消化可以產生帶有非互補的粘性末端，這DNA重組中zui容易克隆的DNA段。一般情況下，常用質粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在pcr擴增時，在DNA段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。該種粘性末端的連接載體DNA和外源DNA的分子數比（濃度比）通常為為1：1。
（3）平頭末端的連接
是由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生，或由DNA聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應中，T4 dna連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇（PEG 8000）以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質以提高轉化效率。特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配，則可以在線狀質粒載體末端或外源DNA段末端接上合適的接頭（linker）或銜接頭（adapter）使其匹配，也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端，使不相匹配的末端轉變為互補末端或轉為平末端后再進行連接。
4.1.2 DNA連接酶類型
能用于連接DNA的酶有2種：大腸桿菌連接酶和大腸桿菌T4噬菌體所編碼的T4-DNA連接酶。前者的反應需要NAD+參與催化，而T4連接酶的反應則需要ATP參與催化。zui初的研究表明，大腸桿菌連接酶只能催化粘端的連接，現在發現在PEG或聚蔗糖存在的條件下，也能進行平端的連接。相比較而言，T4-DNA連接酶并不需要PEG等的存在就能進行平端的連接，所以現在實驗中絕大多數情況下使用T4-DNA連接酶。
4.1.3 DNA連接的影響因素
連接反應的影響因素包括溫度，時間，酶量，緩沖體系，DNA末端的性質（見4.1.1）及濃度，DNA段的大小等。
（1）溫度與時間
連接反應的一項重要參數是溫度，理論上連接反應的*溫度是37℃，此時連接酶的活性zui高。但37℃時粘性末端分子形成的氫鍵配對結構極不穩定，因此人們找到了一個既可zui大限度地發揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結構穩定的zui適溫度即12~16℃。一般粘性末端的連接在此溫度下，反應30min即可取得較好的效果，如時間充裕的話連接60min則更*些，為了實驗方便有時也在4℃條件下連接過。而對于平頭末端的連接，建議在37℃條件下連接，并且時間適當延長。
（2）酶量
酶單位的定義在寶生物工程公司提供的T4-DNA連接酶中是指在20ml的連接發應體系中，6mg的l DNA-HindIII的分解物在16℃下發應30min時，有90%以上的DNA段進行連接的酶量為1U。由以上的定義可知，日常連接實驗中的DNA的濃度比酶量定義的狀態下低很多10～20倍，所以實際酶量是過量的。平頭末端的連接酶的用量要比粘性末端連接所需酶量大10~100倍，因此廠商提供的連接酶濃度往往是高濃度的（寶生物的T4-DNA連接酶濃度350U/ml）。故從這個意義上分析，常規的粘性末端的連接反應體系中酶量的加入往往是過量的。
（3）緩沖體系
不同公司的連接酶緩沖液大部分含有Tris-HCl（pH 7.5）提供連接所需的合適pH值。另外在緩沖液中還有兩種主要成份非常重要：DTT和ATP。前者提供一定的還原能力，而后者能促進連接反應的有效進行。但是在實驗中緩沖液使用時的反復凍融會引起ATP的分解，從而影響連接效率。為了保證實驗的順利進行，一般大劑量的緩沖液可以分裝成小管保存并使用，另外可考慮使用一段時間的緩沖液定期更新一下。
（4）DNA濃度
DNA連接反應中建議的DNA連接濃度為0.1~1pmol/ml，，而為了降低載體分子間的環化，載體DNA的濃度不宜過高，外源DNA的投入量則依據連接類型不同投入1～10倍。
4.2 試劑與器材
1. 試劑 （1）外源DNA和載體DNA
（2）T4-DNA連接酶
2. 器材 （1）eppendorf管、槍頭
（2）移液器
4.3實驗步驟
4.3.1 常規DNA分子的連接
（1）用適當限制酶消化載體質粒和外源DNA，必要時用瓊脂糖凝膠電泳分離片段。
（2）載體DNA取A ml，外源DNA取B ml，充分混勻后于42℃保溫10分鐘后，迅速冷卻到0℃（可省略，熱脈沖是為了提高兩種DNA分子碰撞的概率）。
（3）再按設計的反應體系依次加入：10×T4-緩沖液，T4-DNA連接酶。
（4）置于16℃連接1h以上，待用。
建議連接體系（可根據樣品濃度進行適當調整）：
ddH2O（ml） 外源DNA（ml） 載體DNA（ml） Buffer（ml） Enzyme（ml） Total（ml）
13-A-B B A 1.5 0.5 15
4.3.2 PCR產物與T-載體連接
（1）回收的PCR擴增產物直接與pMD18-T載體連接，連接反應按如下：
5×Buffer pMD18-T PCR產物 T4-DNA ligase ∑
2ml 0.5ml 7ml 0.5ml 10ml
（2）16℃連接1h以上，用于轉化。