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士鋒生物植物體內脫落酸、赤霉素的分離和測定
點擊次數：831 發(fā)布時間：2013-9-22
在研究植物生命活動過程中，常常需要準確了解某一激素的含量以及各激素間的比例。因此，植物內源激素的提取分離和測定是植物生理學實驗技術中極其重要的內容。本實驗以ABA和GA為例，介紹激素的提取、分離及測定的基本原理和方法。
一、原理 利用脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic acid，GA）能溶解于有機溶劑（如丙酮、甲醇）的特性進行提取，將粗提物經過一系列的分離技術（如萃取、薄層層析或紙層析等），使ABA、GA與其它成分分離。再對純化的ABA和GA進行生物學鑒定或物理化學鑒定。
（一）生物鑒定1.ABA能抑制植物器官的生長，在一定的濃度條件下，其抑制程度與濃度呈線性關系。利用這一線性關系就可確定組織中ABA的含量。2.GA能刺激幼嫩植物的節(jié)間伸長，特別是矮生植物的莖。在一定濃度范圍內，莖的伸長度與GA濃度呈線性關系。因此，根據莖的伸長度就可確定GA的含量。
（二）物理化學鑒定：可采用氣相色譜法。
二、材料、儀器設備及試劑
（一）材料：植物葉片、水稻種子及幼苗等；
（二）儀器設備：1.氣相色譜儀；2.分液漏斗；3.組織勻漿器；4.旋轉蒸發(fā)干燥器；5.層析缸；6.華特曼-3號層析紙；7.微量注射器。
（三）試劑：1. 100％甲醇；2. 80％甲醇；3. 石油醚；4. 乙酸乙酯；5. 1mol/LHCl；6. 硅酸GF232；7. 氯仿；8. GA；9. ABA；10. 乙醇；11. 正丁醇；12. 異丙醇；13. 3mol/L氨水。
三、實驗步驟與結果計算
（一）脫落酸和赤霉素的提取和分離
1.樣品提取（1）取新鮮材料或貯存材料（用100％甲醇固定，放置-10℃冰箱中至待測時）10g，剪碎，加入60ml預冷（＜0℃＝的80％甲醇溶液，勻漿5min，勻漿液在4℃下振蕩（或攪拌）24h，過濾。殘渣再用20ml甲醇液振蕩1h。反復二次，濾液混合。（2）將濾液在旋轉蒸發(fā)器上干燥減壓蒸發(fā)（36～38℃）至原體積一半，再加入10ml石油醚提取部分色素，將下層甲醇液取出，棄掉石油醚層，繼續(xù)減質濃縮至水溶液。在此水溶液中含有IAA、ABA、GA和CTK等。
2.樣品萃取將水溶液用1mol/LHCl調pH至2.8～2.5左右。并以與水溶液等體積的乙酸乙酯萃取。將混合溶液裝入分液漏斗，分離水相和乙酸乙酯相。取水相再用乙酸乙酯萃取2次。合并乙酸乙酯溶液。此時，CTK（細胞分裂素）存在于水相中，而ABA、GA、IAA存在于乙酸乙酯中。