QQ交談
您所在位置：請輸入產品關鍵字：
郵編：200431
聯系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機：13122441390 15900755943
留言：發送留言
個性化：www.shifengsj.com
網址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://www.js967.com/st236594/
士鋒生物原核表達實驗前分析設計
點擊次數：1447 發布時間：2013-9-2
在下面將列出幾個影響表達的因素，大家可以在表達前根據這幾個因素自己分析一下：
1.翻譯起始位點
現在大部分的表達載體都提供起始位點，所以它已經把起始密碼子與核糖體結合位點的距離進行優化了，一般情況下不需要自己再加，不過還是要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子
2.GC含量
表達序列中的GC含量超過70%的時候可能會降低蛋白在大腸桿菌中的表達水平。GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite等軟件進行預測。
3.二級結構
在起始密碼子附近的mRNA二級結構可能會抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產生不*的蛋白。如果利用軟件分析DNA或RNA結構上有柄（stem）結構，并且結合長度超過8個堿基，這種結構會因為位點專一突變等因素而變得不穩定。
4.基因或者蛋白的大小
一般說來小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達的。蛋白越小，越容易被降解。在這種情況下可以采取串聯表達，在每個表達單位（即單體蛋白）間設計蛋白水解或者是化學斷裂位點。如果蛋白較小，那么加入融合標簽GST、Trx、MBP或者其它較大的促進融合的蛋白標簽就較有可能使蛋白正確折疊，并以融合形式表達。
對于另一個，大于60kD的蛋白建議使用較小的標簽，如6×組氨酸標簽。對于結構研究較清楚的蛋白可以采取截取表達。當然表達時要根據目的進行截取，如果是要進行抗體制備而截取，那么一定要保證截取的部位抗原性較強。對于抗原性也可以利用軟件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在線軟件，不過在分析之余也要認識到這是一種數據統計的結論，如果蛋白和免疫動物親緣關系較遠的話還是不妨一試的。
5.親疏水性
這也是一種經驗之談，相信經常做表達的人都發現表達親水區域時表達量會比較高，如果你要表達一個膜蛋白，那么勸你做好長期抗戰的準備吧。有許多軟件可以對氨基酸的親疏水性進行分析，比如Vector NIT Suite，除此之外還可以利用在線跨膜區預測軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 對跨膜區進行預測。
對于自己表達的蛋白有所了解后就可以開始對載體進行選擇了，目前商業化的載體基本上包含以下幾個元件：
除了上面標出的元件外還需要有復制起點，它對于控制質粒的拷貝數非常重要;另外就是篩選標記了，比如藍白斑篩選的lacZ，各種抗生素標記。在以上幾個元件中，我們需要注意的是負責調節與啟動的元件，也就是調控子和啟動子。其中啟動子對于蛋白表達的速度起著舉足輕重的作用，它與zui終蛋白的表達量、是否可融密不可分。這里，對于世面上廣泛銷售的幾種原核表達載體使用的啟動子進行總結。
| 啟動子 | 來源 | 調控手段（濃度） | 強度 |
| LacUV5 | 乳糖操縱元 | lacI/IPTG （0.1-1mM） | 強 |
| Trp | 色氨酸操縱元 | trpR 3- β - 吲哚丙烯酸 | 強 |
| Tac | 結合了色氨酸啟動子的 -35 序列和乳糖啟動子的 -10 序列 | lacI/IPTG （0.1-1mM） | 強 |
| PL | λ噬菌體 | λ cI 阻遏物 / 溫度 | 強 |
| 噬菌體 T5 | T5 噬菌體 | lacI/IPTG （0.1-1mM） | 強 |
| pBAD | 阿拉伯糖操縱元 | AraBAD/ 阿拉伯糖（ 1 μ m-10mM ） | 嚴謹 |
| T7 | T7 RNA 聚合酶 | lacI/IPTG （0.1-1mM） | 非常強 |
乳糖操縱子是應用zui廣泛的調控模式，除了IPTG這種化學誘導方式之外還有利用吲哚丙烯酸和阿拉伯糖的化學誘導。如果你害怕這些化學物質會損害細菌的生長，那么你可以嘗試利用溫度誘導的載體，如：pDH2。它利用PL啟動子，在溫度上升到42℃后進行誘導表達。
可以看到在所有啟動子里屬T7啟動子zui強，它可以將大腸桿菌的資源zui大程度地調用過來表達外源蛋白。這樣一些難表達的蛋白都可以在pET系統里面表達出來，但是是不是越強就越好呢?如果你需要表達蛋白是可溶的，那么T7啟動子就不那么適合了。較弱的啟動子轉錄速度較慢，這樣對于表達可溶、穩定、完整的蛋白比較有利。
Novagen可以說是的pET系統是zui的T7啟動子表達系統，可是當T7啟動子的強啟動效應不受歡迎的時候怎么辦呢?在這里給讀者留個小小的疑問，看看大家有沒有仔細看筆者寫的Novagen篇。提示一下，雖然它轉錄速度快，但是可以控制它的拷貝數，又或者是……利用這些原理Novagen載體也可以毒性高的外源蛋白。
載體上除了啟動子這個需要注意之外，另外一個就是標簽了。很多標簽是為了增加蛋白的可溶性，也有一些是為了方便鑒定表達產物，所以在表達時可以選擇加標簽。是否加標簽要看個人需要，筆者認為如果是表達一個人家沒表達過的蛋白還是加標簽，這樣方便將來鑒定。如果從經濟角度考慮加入6×組氨酸標簽，筆者曾經以為加什么標簽都無所謂（前提是不需要融合表達），結果加了個Novagen的T7?Tag，等到鑒定的時候發現單抗那么貴。而且還不好買的，一些較少人用的標簽會讓你很傷腦筋。這也是表達前要準備的功課之一哦。
好了，如果你選好了載體，那么下一步就是設計引物的。相信大多數人都是利用PCR把目的基因調出來的吧。設計引物可以使用一下兩個軟件，Primer Premier或者Oligo。如果要表達全長，其實也就沒那么多要考慮，從一頭一尾找至少8個匹配序列在加上與載體匹配的序列就可以了。
不過，我還是有以下幾點提醒一下各位：
1.這一點其實很容易理解，但是有時也容易被遺忘。那就是先查查表達外源片段中含有什么內切酶位點，不要設計重了，否則酶切時發現怎么老是有預期外的小片段出現。
2.根據載體上的酶切位點設計引物，現在許多類似T載原理的克隆方法也可以應用到原核表達中了，如果T載克隆方法要定向很多時候要多加4個堿基，設計引物時候可別忘了加。在設計酶切位點的5’端不要忘了加保護堿基，不同內切酶所需的保護堿基不同，SalⅠ不需要保護堿基，EcoRⅤ需要1個，NotⅠ需要2個，HindⅢ有3個。一般情況下，都設計2個。
3.注意啟始密碼子和終止密碼子的讀碼框。如果載體上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是緊跟外源片段的，如果中間含有載體序列，務必確定中間這段序列不會造成你外源序列的移碼。按情況需要，可以加1到2個堿基在引物中使讀碼框正確。有始有終，同樣正常的終止密碼子才能保證蛋白的產出。大部分載體也有終止密碼子，如果你對載體的不放心，也可以在引物中設計上終止密碼子，這樣*。
4.還有就是設計一對引物需要注意的地方：一對引物之間Tm值相差不宜過大，能一樣;一對引物不宜形成發夾結構、互相配對，若配對時不要是G-C的結合（可以用軟件分析）;3'端以G、C結尾為宜等等。如果要詳細研究可以看一下PCR技術的相關書籍，很厚。還有就是記得把上游引物設計成有義鏈，下游設計成反義鏈，否則就沒有片段出現了。雖然這是很小的地方，可是經常會被忽略。
5.如果你是進行截取表達，那么除了之前提到的要注意截取親水區，還有一點就是對密碼子的使用頻率進行分析。如果在大腸桿菌中使用較少的密碼子在外源片段中連續出現，還是避開它為上策。
看完這么多是不是覺得有點思緒萬千呢。以前給我上課的一位教授說過，做試驗，那要大膽設計，小心求證。快去合成引物開始表達吧。