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技術文章
封閉劑在細胞免疫熒光中的應用步驟
點擊次數：2606 發布時間：2013-4-7
I、步驟：
一、固定：
PBS 5min×3次 振蕩洗滌制作好的細胞爬片。
固定液覆蓋細胞，RT 靜置15min。
PBS 5min×3次 振蕩洗滌。
二、通透化：
通透液覆蓋細胞，RT 靜置30min。
PBS 5min×3次 振蕩洗滌。
三、封閉：
封閉液覆蓋標本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：
一抗以合適濃度稀釋PBS，覆蓋標本表面。
4℃孵育過夜，第二天37℃復溫1h。
PBS 5min×3次 振蕩洗滌。
五、二抗孵育：
FITC標記二抗以合適濃度稀釋于PBS，覆蓋標本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌。
六、染核：
新鮮稀釋Hoechst覆蓋細胞表面，RT避光靜置<10min。
PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌。
七、封片：
在干凈的載玻片上滴一滴封片劑，將爬片的細胞面扣在封片劑上。
八、鏡檢，4℃避光保存。
II、注：
1、細胞密度要合適，狀態較好。
2、從孵育二抗開始要避光（關閉室內日光燈即可）。
3、完成后及時鏡檢，照相;分別用不同波長激發熒光，在Photoshop軟件下合成一張圖。
III、試劑配制：
1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：
4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加熱至60℃，持續攪拌至*溶解，（通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。
2、通透液：0.5 %（v/v）TritonX-100/PBS
3、封閉液：正常山羊血清稀釋于PBS;或商品化封閉液成品。
4、Hoechst：Hoechst33258即可。
5、封片劑：50%（v/v）甘油/PBS。