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細胞培養(yǎng)中死活細胞測定及細胞活力測定實驗
點擊次數(shù)：3591 發(fā)布時間：2013-3-23
細胞培養(yǎng)過程中需要測定細胞的存活率以了解細胞的生長狀態(tài)，鑒定細胞存活常用的方法有染色法和儀器分析法。染色法可直接通過細胞形態(tài)，區(qū)別細胞死亡，它是一種簡單的細胞存活鑒定方法。這里總結下死活細胞測定及細胞活力測定實驗原理、實驗步驟及注意事項。
【實驗原理】
（一）染色法是常用的細胞死活鑒定方法，簡便，易于操作。實驗是利用了死活細胞在生理機能和性質上的差異來進行的。死活細胞在生理機能和性質上的差異主要體現(xiàn)在：
（1）死活細胞細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質選擇性的通過;而細胞死亡之后，細胞膜受損，通透性增加。
（2）死活細胞在代謝上的差異：由于活細胞中新陳代謝的作用，使細胞內具有較強的還原能力，而死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們的無還原能力或還原能力極弱。
常見的細胞染料有：中性紅（細胞器的專有染料）、臺盼藍、甲基藍、美藍、熒光素雙醋酸酯（FDA）等。
① 中性紅染色：常用染料之一，是細胞器的專有染料。利用細胞膜的通透性差異，用來染原生動物和顯示動植物組織中活細胞的內含物等。中性紅無毒，常做活體染色的染料。
② 臺盼藍染色：當細胞損傷或死亡時，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA 結合，使其著色。而活細胞能阻止染料進入細胞內。故可以鑒別死細胞與活細胞。嚴格來說，臺盼藍染色檢測的是細胞膜的完整性，通常認為細胞膜喪失完整性，即可認為細胞已經(jīng)死亡。通過顯微鏡很容易就能識別出死亡的被臺盼藍染色的細胞，并可使用細胞計數(shù)器進行計數(shù)。
③ 美藍染色法：美藍是一種無毒性染料，它的氧化型是藍色的，而還原型是無色的，用它來對活細胞進行染色，由于細胞中新陳代謝的作用，使細胞內具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以活細胞無色，而對于死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。因此，用美藍水浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細胞.
④ 甲基藍染色法：甲基藍染色與臺盼藍類似的染色機理。
（二）植物細胞質壁分離法及活體染色測定細胞死活
（1）質壁分離法：成長的植物細胞一般具有中央液泡，在中央液泡和細胞壁之間為細胞質的薄層及其內外膜——液泡膜和質膜。液泡中的胞液具有一定的溶質勢（或稱滲透勢），而活的原生質特別是液泡膜和質膜則具有半透性。所以，當細胞與外界溶液接觸時，便與外液構成滲透系統(tǒng)，并可能發(fā)生水分的移動。若外液的水勢低于胞液的溶質勢，則水分外滲的結果可使原生質隨著液泡一起收縮而脫離細胞壁，發(fā)生質壁分離，質壁分離的細胞與水或水勢較高的溶液接觸時，可重新吸水而是質壁分離復原。
（2）活體染色法：活體染色是利用某種對植物無害的染料稀溶液對活細胞進行染色技術。中性紅是常用的染料之一，它是一種弱堿性pH6.4～8.0之間（由紅變黃），在中性或微堿性環(huán)境中，植物的活細胞能大量吸收中性紅并向液泡中排泌，由于液泡在一般情況下呈酸性反應，因此，進入液泡的中性紅便解離出大量陽離子而呈現(xiàn)桃紅色。在這種情況下，原生質和細胞壁一般不著色。死細胞由于原生質變性凝固，胞液不能維持在液泡內，因此，用中性紅染色后，不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象，相反，中性紅的陽離子卻與帶有一定負電荷的原生質及細胞核結合，而使原生質與細胞核染色。
【實驗步驟】
1、 試劑的配置：
① 臺盼藍：4%臺盼藍母液：稱取4g臺盼藍，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml，用濾紙過濾，4度保存。使用時。用PBS稀釋至0.4%。
② 中性紅：先配成1%中性紅水溶液（1克中性紅溶于100毫升蒸餾水中）。取這種溶液1毫升，用0.6%生理鹽水（或蒸餾水）稀釋到50毫升，即成0.02%中性紅水溶液，貯存在棕色瓶里，放在黑暗處。
③ 美藍：取0.5克美藍，溶于30毫升95%酒精中，加100毫升0.01%氫氧化鉀溶液，保存在棕色瓶內。此溶液能染細胞核，還用來染細菌、血和神經(jīng)組織等。
④ 甲基藍：取1克甲基藍，溶于29毫升70%酒精中，加入70毫升蒸餾水，即成1%甲基藍染液。
2、 染色操作步驟：略
3、 細胞活力測定：染色過的細胞材料，放在顯微鏡下觀察。凡未染或染色及淺的細胞是有活力的，而染色深的細胞是無活力的死細胞。
4、 按公式計算出細胞活力。 細胞活力（%）=未染色的細胞數(shù)/觀察的細胞總數(shù) X 100%
【注意事項】
1. 臺盼藍對人體有毒
2. 對細胞進行染色時，時間不宜過長。否則，部分活細胞也會著色，會干擾計數(shù)。