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技術(shù)文章
單細胞凝膠電泳的操作流程與注意事項
點擊次數(shù)：2427 發(fā)布時間：2013-1-11
單細胞凝膠電泳（又名彗星實驗）的操作流程主要包括單細胞懸液的制備、凝膠板制備、細胞裂解與解旋、電泳與中和、染色和觀察等步驟。本文總結(jié)了單細胞凝膠電泳操作步驟和注意事項，希望對初入實驗的同學(xué)有幫助。
1、分離制備單細胞懸液：
（1）體外培養(yǎng)的細胞株：用胰酶消化，zui后用PBS懸浮吹打成單細胞懸液，細胞要計數(shù)，具體的量我前邊已經(jīng)說過。
（2）體內(nèi)臟器細胞：處死動物，取出臟器，于Hanks’液中制備成單個細胞懸液。
2、膠板制備：
（1）取100μl于45℃水浴中保溫的0.5%NMA，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠。蓋玻片推勻，不能有氣泡，4度凝固5至8分鐘。
（2）水平取下蓋片，取100μl于37℃水浴中保溫的0.5%LMA與20μl細胞懸液（約400個細胞）混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4度凝固5至8分鐘。
3、細胞裂解與電泳：
（1）將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小時。
（2）取出膠板，用雙蒸水浸沒漂洗后放入電泳槽中，浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋20分鐘。
（3）玻片水平放置陽附近，4℃電泳20到25分鐘（25V，300mA）。可在電泳槽周圍加冰塊以保持低溫。
4、中和與染色：
（1）電泳結(jié)束，將膠板浸泡于中和液中，每次10分鐘，共中和3次，每次要更換中和液。zui后晾干。
（2）取出膠板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗處染色5到10分鐘。
（3）蒸餾水漂洗2次，每次5分鐘。
稍晾干，濾紙吸去多余水分，盡快在熒光顯微鏡下觀察。
注意事項：
1.細胞一定要消化成單個的，如果你養(yǎng)的細胞是懸浮生長的，或者形狀是圓形的（例如hela），那么你可以直接用細胞刮收細胞做，否則，如果細胞是非圓形的，例如成纖維細胞等，一定要用胰酶消化，使之成圓形，然后才可做實驗。很多做彗星實驗總是出不來結(jié)果的，可以考慮下是否是這方面的原因。
2.電泳時，電流與電壓強度在每次實驗時要恒定（例如：20V，200mA恒定），這樣出來的慧尾才有分析價值，否則你不知道分析因素的差異是由電泳條件的改變引起的還是細胞處理不同引起的。
3.關(guān)于掉膠的問題：蓋玻片兩面都涂上剝離硅烷（挺便宜的一大瓶，但是有毒），這樣會好很多
4.裂解液是整個實驗中zui關(guān)鍵的因素，裂解液zui終使用時必須是澄清沒有任何沉渣的，如果沒有溶解好是肯定影響實驗的，如果常溫不容易溶解的話可以放入4℃冰箱中一段時間，就比較容易溶解了
小結(jié)：本實驗所有操作步驟從膠板制備開始到zui后都應(yīng)該在暗光或者紅光下操作，實驗的關(guān)鍵步驟是凝膠制備，一定要均勻平整無氣泡，此外要避免試驗中細胞裂解液等有毒物質(zhì)對自己的傷害
1、分離制備單細胞懸液：
（1）體外培養(yǎng)的細胞株：用胰酶消化，zui后用PBS懸浮吹打成單細胞懸液，細胞要計數(shù)，具體的量我前邊已經(jīng)說過。
（2）體內(nèi)臟器細胞：處死動物，取出臟器，于Hanks’液中制備成單個細胞懸液。
2、膠板制備：
（1）取100μl于45℃水浴中保溫的0.5%NMA，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠。蓋玻片推勻，不能有氣泡，4度凝固5至8分鐘。
（2）水平取下蓋片，取100μl于37℃水浴中保溫的0.5%LMA與20μl細胞懸液（約400個細胞）混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4度凝固5至8分鐘。
3、細胞裂解與電泳：
（1）將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小時。
（2）取出膠板，用雙蒸水浸沒漂洗后放入電泳槽中，浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋20分鐘。
（3）玻片水平放置陽附近，4℃電泳20到25分鐘（25V，300mA）。可在電泳槽周圍加冰塊以保持低溫。
4、中和與染色：
（1）電泳結(jié)束，將膠板浸泡于中和液中，每次10分鐘，共中和3次，每次要更換中和液。zui后晾干。
（2）取出膠板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗處染色5到10分鐘。
（3）蒸餾水漂洗2次，每次5分鐘。
稍晾干，濾紙吸去多余水分，盡快在熒光顯微鏡下觀察。
注意事項：
1.細胞一定要消化成單個的，如果你養(yǎng)的細胞是懸浮生長的，或者形狀是圓形的（例如hela），那么你可以直接用細胞刮收細胞做，否則，如果細胞是非圓形的，例如成纖維細胞等，一定要用胰酶消化，使之成圓形，然后才可做實驗。很多做彗星實驗總是出不來結(jié)果的，可以考慮下是否是這方面的原因。
2.電泳時，電流與電壓強度在每次實驗時要恒定（例如：20V，200mA恒定），這樣出來的慧尾才有分析價值，否則你不知道分析因素的差異是由電泳條件的改變引起的還是細胞處理不同引起的。
3.關(guān)于掉膠的問題：蓋玻片兩面都涂上剝離硅烷（挺便宜的一大瓶，但是有毒），這樣會好很多
4.裂解液是整個實驗中zui關(guān)鍵的因素，裂解液zui終使用時必須是澄清沒有任何沉渣的，如果沒有溶解好是肯定影響實驗的，如果常溫不容易溶解的話可以放入4℃冰箱中一段時間，就比較容易溶解了
小結(jié)：本實驗所有操作步驟從膠板制備開始到zui后都應(yīng)該在暗光或者紅光下操作，實驗的關(guān)鍵步驟是凝膠制備，一定要均勻平整無氣泡，此外要避免試驗中細胞裂解液等有毒物質(zhì)對自己的傷害