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單個細(xì)胞的PCR分析
點(diǎn)擊次數(shù)：1245 發(fā)布時間：2017-8-16
單個二倍體細(xì)胞
在分析單精子以前，Li等人對個體二倍體細(xì)胞內(nèi)的β珠蛋白基因進(jìn)行過研究。兩 個組織培養(yǎng)細(xì)胞株用于這些實驗。其中一個純合是鐮刀型細(xì)胞密碼子6（βS）發(fā)生突 變，另一個純合子則來源于正常的βB等位基因。擴(kuò)增含有密碼子6的β珠蛋白片段的 引物，及能夠區(qū)別這兩個特異的等位基因的寡核苷酸探針（ASO）已經(jīng)報道過。βA純 事細(xì)胞和βB純合細(xì)胞和βS純合細(xì)胞在同一組織培養(yǎng)瓶中共同培養(yǎng)數(shù)天。將用相差顯 微鏡觀察到的混合培養(yǎng)的單個細(xì)胞轉(zhuǎn)入溥塑料胡管內(nèi)。分別將單個細(xì)胞轉(zhuǎn)入含裂解液 的PCR管中，保溫后，加入PCR緩沖液，緩中有四種dDNP．Taq dna聚合酶和擴(kuò)增已知 珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分鐘變性靶DNA，然后根據(jù)已發(fā)表方法的改進(jìn)方案進(jìn)行 50全循環(huán)的擴(kuò)增。通過打點(diǎn)雜交，等量的擴(kuò)增產(chǎn)物打點(diǎn)于尼龍膜后，擴(kuò)增產(chǎn)物分別與 βA和βS的探針雜交。所分析的37個細(xì)胞中，84％細(xì)胞只與βA和βS探針雜交，雜交 強(qiáng)弱各不相同；19個與βA探針．12個與βS探針雜交。12個以水作空白對照的反應(yīng)管 中瓜呈陰性，它表明忽略不記DNA的污染。沒有與兩種探針都雜交的樣品，它暗示轉(zhuǎn) 入到反應(yīng)管中的單個細(xì)胞，而且組織培養(yǎng)基中存在的從βA或βS細(xì)胞中裂解出來的 DNA并未吸附在單個細(xì)胞上。
單個細(xì)胞的pcr擴(kuò)增產(chǎn)生的β珠蛋白基因的數(shù)量通過與已知攜帶蛋白基因的質(zhì)粒 DNA樣品在雜交模上的雜交信號的強(qiáng)度進(jìn)行比較確定。據(jù)估計PCR反應(yīng)開始時，一個二 倍體細(xì)胞珠蛋白DNA量（3.0X10-24摩爾）在5－500毫微微摩爾之間，每個PCR循環(huán)以 平均效率65％計算，經(jīng)50個循環(huán)后它的DNA相當(dāng)于平均擴(kuò)增了7.6×1010倍。考慮到擴(kuò) 增的程度之大，因此排除任何可能的污染對于單個細(xì)胞的分析十分關(guān)鍵。
單精子的分析
Li等人隨后對位于染色體19編碼LDL受體(LDLr)的基因的雜合體單精子的基因型 進(jìn)行分析。根據(jù)已知的DNA序列，他們用PCR和ASO分析檢測LDLr的RFLP。PCR的引物和 探針以前已有報道。單個精子的分離與二倍體細(xì)胞的分離方法一樣，精液經(jīng)蔗糖梯度 離心得到純化的精子，精子于－20℃可保藏8個月。顯微鏡下將單個精子吸入毛細(xì)塑 料針管內(nèi)，然后轉(zhuǎn)入試管內(nèi)以作裂解。裂解的方法與發(fā)表的方法沖液(50mM KCL， 10mM Tris.HCL，pH8.3，2.5mM MgCl2，0.1mg/ml明膠），0.05mg/ml蛋白酶K，20mM DTT和1.7μM SDS。37℃保溫1小時，加入pcr反應(yīng)物以前，樣品加熱到85℃。PCR擴(kuò) 增。對80個精子LDLr基因型已作過分析。55%的雄配子顯示出雜交信號。22個攜帶 LDLr等位基因，21個攜帶LDLr2基因。僅一個與兩種探針雜交都呈陽性。16支對照反 應(yīng)管中加入所有反應(yīng)試劑但沒有精子，結(jié)果無雜交信號出現(xiàn)。兩個擴(kuò)增的等位基因的 分布遵循Mendel獨(dú)立分離定理，它表明PCR反應(yīng)以單個減數(shù)分裂產(chǎn)物為起始，無污染 的二倍體DNA存在。