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PCR操作范例及反應體系的組成
點擊次數(shù)：2965 發(fā)布時間：2017-8-14
一、PCR操作范例
在一個典型的pcr反應體系中需加入：適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg2+和兩個合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min，引物與模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在循環(huán)前模板預變性3～5min；在末次循環(huán)后，樣品仍需繼續(xù)延伸3～5min以上，確保擴增的DNA為雙鏈DNA。為便于了解PCR反應中各成份的組成，加入量和反應條件，使人們以此為基礎(chǔ)，對不同的研究對象逐項改變來找到*反應條件，特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應條件供參考。
表22-1 PCR反應混合液
成分
加入體積（μl）
zui終濃度
雙蒸餾水
53.5
10×反應緩沖液[1]
10.0
[1×]Mg2+1.5mmol/l K+50mmol/L
4×dNTPs(各1.25mmol/L)
16.0
各200μmol/L
λ-DNA模板（全長48.5kD）
10.0
1ng/次
引物1,2（各25bp,20μmol/L）[3,4]
5.0
1.0μmol/L（100pmol）
Taq聚合酶儲存液[2]
0.5
2U/100μl
總體積（pH8.3）
100.0
石蠟油
50～100.0
擴增條件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30個循環(huán)。
注：[1]反應緩沖液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),
15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2,
0.01%(W/V)明膠（Sigma G2500）
[2]酶儲存緩沖液（-20℃）含：50%甘油，100mmol/l KCl,
20mmol/L Tris-HCl ph8.0
0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT
200μg/ml明膠
0.5%吐溫20，0.5% Nonidet P40
[3][4]引物，1，2：擴增λ-噬菌體基因中500bp的片段
引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)
引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)
注意（3’）端有2個bp互補故易生成50bp的雙體
二、PCR反應系統(tǒng)的組成
（一）PCR緩沖液（PCr Buffer）
用于PCR的標準緩沖液見PCR操作范例。于72℃時，反應體系的pH值將下降1個單位，接近于7.2。二價陽離子的存在至關(guān)重要，影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實驗表明，Mg2+優(yōu)于Mn2+，而Ca2+無任何作用。
1．Mg2+濃度Mg2+的*濃度為1.5mmol/L(當各種dNTP濃度為200mmol/L時)，但并非對任何一種模板與引物的結(jié)合都是*的。使用靶序列和引物結(jié)合時，都要把Mg2+濃度調(diào)到*，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg2+過量易生成非特異性擴增產(chǎn)物，Mg2+不足易使產(chǎn)量降低。