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定位候選克隆
點擊次數：1220 發布時間：2016-9-13
當前，人類基因組研究的重心正在由“結構”向“功能”轉移，一個以基因組功能研究為主要內容的所謂“后基因組時代”(post-genomics)，也即功能基因組(functional genomics)時代，即將到來。如何獲取基因的功能信息，即與人類重大疾病和重要生理功能相關的基因信息，就擺在了我們面前。定位候選克隆策略(positional candidate cloning)是傳統定位克隆(positional cloning)的改進和發展，并以其在克隆疾病相關基因中的有效性而日益受到重視。
人類基因組計劃已確定了一系列分布于全基因組24條染色體上的分子標記。根據這些分子標記的序列和定位信息，結合雜交或PCR的方法可以快速檢測染色體上與腫瘤或遺傳性疾病相關的熱點位置，進而從中克隆疾病相關基因。定位候選克隆克服了經典的定位克隆純粹依靠連鎖分析進行染色體定位的繁冗而緩慢的弊端，大大加快了克隆工作的進程，而且它也不僅僅局限于遺傳病，現在已更多地運用于腫瘤易感基因的克隆工作。1994年上開始構建并于1996年公布的基因圖譜是一個以cDNA為基礎的STS(sequence-tagged site)標記的物理圖和多態性微衛星標記的遺傳圖相結合的圖譜，它一方面使染色體定位更加準確、可靠、精密，同時為從候選區域內獲得疾病相關的候選基因提供了極大的便利，使得目的基因的克隆更加簡便而快捷，為這種方法的發展和應用注入了更大的活力，表現為此后相繼克隆出16條新的疾病相關基因，如從胰腺癌中分離得到的抑癌基因DPC4等。1998年10月GeneBank公布了的“基因圖譜98”，它的信息量更大，且準確度和度都有大幅度的提高，包含有41 464個STS標記，代表了30 181條基因的定位信息，也即完成了人的全部基因組約6萬～7萬條基因中的一半左右的定位工作［2］。總之，隨著人類基因組計劃的推進，定位候選克隆已成為一種有效的克隆疾病相關基因的方法。
包括三個基本步驟：基因組定位、候選cDNA的獲得、全長及功能分析。本文即對此策略的發展和應用作一概要介紹。
1.基因組定位
新發展起來的，尤其在分離腫瘤易感基因中常用的方法是用PCR方法檢測多樣本的雜合性丟失(LOH)或純合性丟失的高發頻率區，從而獲得疾病候選基因定位［3］。體細胞抑癌基因的失活是導致癌變的一個主要因素，zui常見的表現即雜合性缺失。通常在染色體上雜合性缺失的高發頻率區含有一個或多個抑癌基因。利用散布于各條染色體上的分子標記(包括STS、微衛星標記等)，用pcr檢測多個腫瘤樣本的染色體各區帶的缺失情況，可確定LOH的高發頻率區，也即確定了相關腫瘤生長負調控因子的染色體定位，并可到基因組分子標記指示的區域，進一步可作基因的克隆工作。利用這一方法已成功地克隆了幾個抑癌基因，如乳腺癌中的BRCA1、BRCA2及胰腺癌中的DPC4基因等。同時，FISH技術的不斷發展及推廣應用，染色體顯微切割技術的成熟，可在顯微鏡下切割特定的染色體區帶，制備染色體區帶特異探針，對正常和病變組織作FISH分析，比較確定疾病相關基因的染色體區帶定位。近些年來，RH譜(radiation hybrid map)的建立，使染色體精細定位成為可能。這些方法比原先連鎖分析的檢測速度更快、度更高。例如L-C Tsui用連鎖分析花費了大約10年的時間才把囊性纖維變性基因定位在7號染色體，而現在可能只要一年或更短的時間就可完成這項工作。
2.候選cDNA的篩選
基因組定位提供的信息包含一定的分子標記，可用PCR或雜交的方法直接從YAC(yeast artificial chromosome)庫，或從BAC(bacterial artificial chromosome)庫、PAC(P1 artificial chromosome)庫中篩選相對應的克隆。YAC庫的嵌合性嚴重且操作難度較大，已逐步為PAC庫和BAC庫取代。PAC系統是以噬菌體P1為基礎的克隆系統，它可容納70～100kb的插入片段，并可選擇性地區分重組子和非重組子，且同時有兩套復制機制。單拷貝復制子可用于穩定克隆增殖，而多拷貝復制子則可在Lac操縱子的控制下用于DNA的制備［4］。BAC系統是基于大腸桿菌中可大容量容納基因且穩定性良好的F因子衍生而來的載體系統，可容納超過100kb的插入片段，BAC克隆的插入片段的平均長度為120kb，zui大可達到240kb左右［5］。良好的穩定性和操作的簡便性是BAC系統的主要優點。由這些克隆入手，采用依賴于適當cdna文庫的方法、依賴于特征序列的方法或依賴于表達性質等方法獲得候選cDNA。
(1) 依賴適當cDNA文庫的方法有直接篩選法和cDNA選擇法(cDNA selection)。直接篩選法即用基因組DNA直接從cDNA文庫中篩選位于該基因組片段內的cDNA，如從覆蓋有候選區域的YAC［6］、PAC［7］、BAC克隆中分離外源片段作為探針從文庫中篩選候選基因；而cDNA選擇法［8］恰恰與直接篩選法相反，它把基因組DNA固定在膜上，用總cDNA與之雜交，通過PCR從中回收可與基因組片段結合的cDNA片段。直接篩選法的優點在于避免了對候選區域大片段地亞克隆操作，且在單一的篩選中可以獲得多個轉錄子的信息。但缺點是大片段地純化，標記較困難，而PAC、BAC克隆片段純化相對方便的優點就成為這種方法發展的趨勢；同時由于探針的復雜性，使雜交背景加深，假陽性增多，而且容易忽略短的外顯子或低豐度cDNA。cDNA選擇法的zui大*性在于PCR反應的介入，大大提高了選擇的靈敏度，可以檢測到一些稀有轉錄子。