丁 平 侯亞莉 程曉偉 重慶市飼料獸藥監察所
黃曲霉素是黃曲霉與寄生霉素產生毒株的代謝產物,它是化學結構相似的一類化合物,根據其結構的差異分別被稱為黃曲霉素B1 、B2 、G1 和G2 等,其中以黃曲霉素B1 zui為常見,也是已知zui強的化學致癌物之一,對糧油食品的污染較為嚴重。飼料檢測
中常以黃曲霉素B1 為指標,我國的飼料*通常為10～50μg/ kg。國內外有關黃曲霉素B1 的檢測方法主要有:薄層色譜法、酶聯免疫測定法、液相色譜法和熒光光度法。試驗采用了免疫親和柱對飼料中黃曲霉素B1 進行凈化,對液相色譜熒光檢測方法進行了研究,為監控飼料中黃曲霉素B1 提供了簡便可行的方法。
1 材料與方法
1. 1 儀器和試劑
儀器 Angilent 1100 液相色譜儀,2475 多波長熒光檢測器,METTLER AE 240 電子天平,振蕩器,渦旋混合儀,微孔慮膜（0. 45μm） ,玻纖濾紙,免疫親和色譜柱（北京安易世紀貿易有限公司提供） 。
試劑 黃曲霉素B1 標準溶液（1 mg/ L） ,由Sig2ma 公司提供,三氟乙酸,甲醇（色譜純） ,水為超純水。
1. 2 溶液的配制
1. 2. 1 樣品提取液取550 mL 甲醇,用水定容至1 000 mL ,混勻。
1. 2. 2 流動相取450 mL 甲醇,用水定容至1 000 mL ,混勻。
1. 2. 3 黃曲霉素B1 衍生標樣的配制分別準確吸取一定量的標準準備液,置于5 mL玻璃試管中,在50 ℃水浴鍋N2 流下吹干,加300μL的衍生化試劑三氟乙酸進行衍生,在室溫下放置3 min。在50 ℃水浴鍋N2 流下吹干,用1 mL 甲醇、乙腈和水等體積混合的溶液溶解,配置成濃度為1、
2、5、10 和20 μg/ L 的標準溶液,分別進行HPLC 檢測。
1. 3 樣品的處理
準確稱取樣品5. 0 g ,置于150 mL 具塞錐形瓶中,加入1. 0 g 氯化鈉和40. 0 mL 樣品提取液,往復振蕩30 min ,用玻纖濾紙過濾。準確移取10. 0 mL濾液并加入30. 0 mL 水稀釋,注入已用水平衡至室溫的IAC 小柱,用3 mL 水淋洗,用3 mL 甲醇洗脫,收集洗液置玻璃試管中,在50 ℃水浴鍋N2 流下吹干。按標準品衍生方法處理后進行HPLC 檢測。
1. 4 回收率的測定
稱取空白飼料5. 0 g ,置于150 mL 具塞錐形瓶中,分別加入標準工作溶液,使樣品中藥物濃度分別為20. 0 、10. 0 和2. 0μg/ kg ,混勻后靜置10 min ,每個濃度水平設4 個平行,按1. 3 的方法分別處理和測定。
1. 5 色譜條件
色譜柱 C18 柱,250 mm ×4. 6 mm ,粒徑5μm;柱溫25 ℃;流動相450 mL 甲醇+ 550 mL 水;激發波長365 nm;發射波長435 nm;進樣量25μL 。
2 結果與分析
2. 1 測定方法的線性響應
取配置好的標準溶液在選定的色譜條件下進行測定, 繪制標準曲線（ 見圖1） 。在濃度為1 ～50μg/ L時拖尾峰（tailing peak）。前者少見。>色譜峰面積與濃度呈線性相關,其回歸方程為y = 2. 524 1 x + 0. 272 2 ,相關系數r2 = 0. 999 8。其線性響應范圍*測定的要求,表明該方法定量測定可靠。
2. 2 測定方法的靈敏度
在試驗條件下,按信噪比（S/ N） 為3 計算,求得飼料中黃曲霉素B1 的檢測限為0. 01μg/ kg ,按S/ N為10 計算,求得飼料中黃曲霉素B1 的定量限為0. 03μg/ kg ,滿足定量分析的要求。
2. 3 添加回收率試驗
添加回收率及結果的變異系數見表1。標準品、空白飼料樣品及添加標準品的飼料樣品的色譜圖見圖2 ,本方法條件下黃曲霉素B1 的保留時間約為8. 3 min。
從表1 可以看出,在3 個飼料添加水平下,黃曲霉素B1 的平均回收率為74. 9 %～81. 6 % ,變異系數為0. 01 %～0. 04 %。
3 討論
本方法采用甲醇- 水提取飼料樣品,通過IAC柱凈化濃縮,以HPLC 熒光檢測法測定黃曲霉素B1的含量。從空白飼料樣品的色譜圖和添加飼料樣品的色譜圖可以看出,黃曲霉素B1 色譜峰附近沒有雜質峰,說明飼料中的雜質對本測定方法沒有干擾。
從表1 看出, HPLC 法有較高的回收率（ 平均77. 5 %） 和良好的重現性（平均變異系數0. 03 %） 。由于黃曲霉素的毒性很大,現在對黃曲霉素的*達到2～4μg/ kg 以下甚至更低。對黃曲霉素含量的*越低,表明對檢測儀器和方法的要求越高。復雜的操作、大量的有機試劑、嚴格的防護條件及對操作者的損害等都不適合形勢發展的要求。試驗用免疫親和色譜- HPLC 法代替了常用的薄層法,減少了操作步驟和有機溶劑的損耗。國標食品中黃曲霉素的測定采用柱后衍生化HPLC - 熒光光度法,試驗采用了這一方法,對儀器的要求降低了。
試驗研究了進樣體積對黃曲霉素B1 峰型的影響,當進樣量為100μL 時,樣品峰的峰型很不對稱,有前延峰。后改用50μL 的進樣量時,峰型得到很大的改變,也很對稱。由于25μL 進樣時也能滿足定量的要求,試驗zui后確定進樣量為25μL 。在樣品提取時,振蕩的時間應足夠,剛開始試驗時,提取時間是15 min ,回收率很低,不能滿足定量的要求。當振蕩時間延長為30 min 時,回收率得到較大的提高,能滿足飼料檢測的要求。
試驗結果表明,免疫親和色譜—HPLC 法操作簡便易行,能滿足分析的要求,是測定飼料中黃曲霉素B1 的一種靈敏且可靠的方法。
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