在做qPCR實驗時，我們經(jīng)常會問：“你是做定量還是相對定量呢？”，而定量方法的選擇是取決于實驗的目標(biāo)。定量可測定目標(biāo)核酸分子的實際拷貝數(shù)，但也是費力、復(fù)雜的定量形式。此方法要求周密的實驗方案和高度準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線，常用于確定病毒滴度。

使用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量

定量是通過樣品的Cq值和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較實現(xiàn)的。首先為了建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要已知拷貝數(shù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行5次以上的連續(xù)梯度稀釋，將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增，后根據(jù)各樣品的拷貝數(shù)濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，其中X0為起始模板量。然后將未知樣本的Cq值與此標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，確定其拷貝數(shù)濃度。

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)模板起始濃度越大時，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Cq值越小。反之，模板起始濃度越小時，Cq值越大。起始模板量的Log值與循環(huán)數(shù)Cq值呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可確定未知待測樣本中目的基因的量。

如何選擇標(biāo)準(zhǔn)品？

如前所述，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線采用的模板將決定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。所以使用與實驗樣本盡可能類似的目標(biāo)模板，可優(yōu)選有證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考物質(zhì)。那么制備標(biāo)準(zhǔn)品的常見方法如下：

?  DNA 標(biāo)準(zhǔn)品：目的靶點的PCR擴(kuò)增片段或含有目的靶點的質(zhì)粒克隆（圖2）。

優(yōu)點：易于生成、定量，可在適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件下維持穩(wěn)定性。

缺點：無法進(jìn)行qRT-PCR 的逆轉(zhuǎn)錄步驟，大大影響了反應(yīng)效率。

PCR擴(kuò)增片段：通過常規(guī)PCR進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，回收純化PCR擴(kuò)增片段，可直接作為標(biāo)準(zhǔn)品，相對于質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增片段不是那么穩(wěn)定。

質(zhì)粒克隆：將目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶后連入T載體，再進(jìn)行質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用。

?  RNA 標(biāo)準(zhǔn)品：目的靶點的體外轉(zhuǎn)錄RNA(圖3)

優(yōu)點：結(jié)合了RT效率，程度地模擬了目的靶點。

缺點：需要耗費時間生成該標(biāo)準(zhǔn)品，因其不穩(wěn)定，難以保持長期準(zhǔn)確度。

體外轉(zhuǎn)錄RNA：利用實時熒光定量PCR生成的PCR 產(chǎn)物可利用包含5’ T7啟動子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆轉(zhuǎn)錄引物重新擴(kuò)增。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成多聚腺苷酸化正義mRNA。純化后可將其準(zhǔn)確定量并稀釋，用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Azure  Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)——定量示例

•方法:從組織中提取基因組DNA，以TaqMan探針法進(jìn)行熒光定量檢測

•試劑:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)