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實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）
基本原理
qPCR 技術是在反應體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應的進行，擴增產物不斷積累，導致熒光信號不斷積累， 從而利用熒光信號的變化實時監測整個 PCR 進程。
根據 PCR 定量原理公式可推導出， 模板起始拷貝數的對數與閾值循環數呈線性關系，模板起始拷貝數越多，熒光信號達到閾值的循環數越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數的標準樣品繪制標準曲線，根據熒光基團發出的熒光強度與 PCR 擴增產物的數量呈對應關系， 只要對熒光信號進行實時監測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標準曲線計算未知樣品的起始拷貝數。
Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定閾值時所經過的擴增循環數。相同模板進行 96 次擴增，終點處產物量不恒定，但 Ct 值卻重現性。
模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環數越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。
目前常用熒光標記方法
方法 | 優點 | 缺點 | 應用范圍 |
SYBR Green I | 適用性廣 靈敏 方便 便宜 | 引物要求高 易出現非特異條帶 | 科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉基因重組動植物研究 |
Taqman | 特異性高 重復性好 | 價格高 只適合特定目標 | 病原體檢測，疾病耐藥基因研究，藥物療效考核，遺傳疾病診斷 |
分子信標 | 高特異性 熒光背景低 | 只適合特定目標 設計困難 價格高 | 特定基因分析，SNP分析 |
熒光定量 PCR 反應體系舉例 | |
試劑 | 含量 |
2xGoTaq Master Mix | 5µl |
無核酸酶水 | 3.5µl |
上游引物 | 0.25µl |
下游引物 | 0.25µl |
基因組 DNA | 1µl（約20ng）梯度稀釋 |
共 10µl | |
儀器與耗材
在普通 PCR 儀的基礎上增加一個熒光信號采集系統和計算機分析處理系統，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴增原理和普通 PCR 儀擴增原理相同，只是 PCR 擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號采集系統實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統得出量化的實時結果輸出，把這 PCR 儀叫做實時熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道，有多熒光標記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記的目的基因表達產物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫學臨床檢測，生物醫藥研發，食品行業，科研院校等機構。
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