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羥脯氨酸（Hyp）檢測原理說明
閱讀：2503 發布時間：2015-6-3羥脯氨酸(Hyp)檢測原理說明
（ 測培養細胞，培養液）
一、原理 羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產生的氧化產物與二甲氨基苯甲醛作用呈現紫紅色，
根據其呈色的深淺可推算出其含量。 二、試劑盒組成與配制：
1、試劑一：粉劑×2 瓶，甲液 10ml×2 瓶，乙液 20ml×2 瓶，臨用時取粉劑一瓶，先加 甲液混勻 10ml 充分溶解（從瓶口向內看，*溶解完）。然后再加乙液 20ml 充分混勻。配好后的試劑 4℃~8℃冰箱保存。
注意點：粉劑加甲液 10ml 后一定一定要*溶解后才能加乙液。
2、試劑二：液體 60ml×1 瓶，4℃冰箱避光保存。
3、試劑三：粉劑×1 支，溶劑 60ml×1 瓶，臨用時將粉劑一支加到 60ml 溶劑中充分溶解， 配好后 4℃避光保存。
4、試劑四：羥脯氨酸標準品 5mg×3 支，4℃冰箱保存。
標準貯備液的配制：測試前將一支標準品用蒸餾水溶解后定溶至 50ml，配成 100μg/ml 的標準貯備 液。
2μg/ml 標準應用液的配制：取 100μg/ml 的標準貯備液 0.2ml 加蒸餾水定溶至 10ml，配成 2μg/ml
的標準應用液，現用現配。
5、消化液：粉劑×1 瓶，溶劑 3ml×1 瓶，4℃冰箱保存。臨用前將粉劑倒入溶劑中，并 用溶劑將粉劑瓶洗干凈，現用現配。
*注意：混勻時用雙手小心旋動小瓶，切勿上下顛倒混勻，以免引起大量氣泡。
三、操作步驟：
1、樣本前處理：（血清及體液可直接進行檢測，組織則需制成勻漿后檢測。） 組織塊稱重，放在勻漿管口部，用小剪刀剪碎，加入 9 倍生理鹽水沖入勻稱管
中，緩慢上下旋轉研磨，每次半分鐘，間隔半分鐘，反復 5 次或者用勻漿機，勻漿時間
10 秒/次，間隔 30 秒，連續 3~5 次，在冰水中進行。勻漿后以 3500 轉/分離心 10 分鐘， 取上清 0.1ml 加 0.4ml 生理鹽水，稀釋成 2%的組織勻漿進行檢測，或者取 0.05ml 10%勻 漿加生理鹽水 0.45ml 制備成 1%勻漿，請做預試后再確定勻漿濃度。（詳見實驗方法學）。
2、消化：
空白管 | 標準管 | 測定管 | |
雙蒸水（ml） | 0.25 | ||
2μg/ml 標準應用液 （ml） | 0.25 | ||
檢測液（ml） | 0.25 | ||
消化液（ml） | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
3、羥脯氨酸測定：
混勻，37℃水浴 3 小時
試劑一（ml） | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
混勻，室溫靜置 10 分鐘
試劑二（ml） | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
混勻，室溫靜置 5 分鐘
試劑三（ml） | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
混勻，60℃水浴 15 分鐘，流水冷卻后，3500 轉/分離心 10 分鐘，取上清（注
意不要混入下面沉淀）在 550nm 處，1cm 光徑，蒸餾水調零，測各管吸光度。
注意：若您的樣本中所含羥脯氨酸過低，可以增加您的樣本取樣量或增加勻漿濃度。
4、蛋白定量。
四、計算與舉例：
1、公式：
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