Dyn,人強啡肽酶聯免疫試劑盒技術指導

l 本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體樣本中人強啡肽（Dyn）的含量。

l 有效期：6個月

l 保存條件：2-8℃

l 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷

 實驗原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人強啡肽（Dyn）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人強啡肽（Dyn）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

Dyn,人強啡肽酶聯免疫試劑盒技術指導需要而未提供的試劑和器材

1． 37℃恒溫箱。

2． 標準規格酶標儀。

3． 自動洗板機。

4． 單通道或多通道可調節移液器以及其吸頭。

5． 蒸餾水，容量瓶等

6． 干凈的試管和Eppendof管。

注意事項

1. 從-20℃取出的試劑盒，在4℃解凍guoye。盒內每一瓶解凍的溶液在開啟瓶蓋之前都要輕輕搖勻，避免解凍時出現的分層，否則會出現濃度不均一的現象。

2. 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。

3. 配制各種試劑時，切記混勻！

4. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。

5. 建議所有標準品、樣本都做雙份檢測。

6. 要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活！

7. 為免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和試管。

洗板方法

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

樣品的準備和保存

樣品如果不立即分析，應分裝后冷凍保存，且避免反復凍融。

血清——用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時或4℃guoye，離心1000×g 10分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

細胞培養、組織勻漿、體液——離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

樣品稀釋的一般原則

用戶須查閱文獻了解標本內待測因子的含量，決定適當的稀釋倍數，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。

試劑的準備和保存

A. 標準品的稀釋和使用：在使用前2小時內準備。將凍干品管內加入1ml樣品稀釋液，*溶解后做倍比稀釋。

8稀釋后的標準品在2小時內使用。

B．生物素標記抗體工作液：在使用前2小時內準備。

1.  根據每孔需要0.1ml計算總的用量（實際配制時應多配制0.1-0.2ml）。

2．按10ul生物素標記抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

C．親和素-過氧化物酶復合物（ABC）工作液的準備：在使用前1小時內準備。

1．根據每孔需要0.1ml計算總的用量（實配時應多配制0.1-0.2ml）。

2．按10ul親和素-過氧化物酶復合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

D. TMB顯色工作液的準備：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液。

操作程序

1． 確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數目。

2． 將倍比稀釋的標準品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對照。處理后的標本按100ul每孔加入。

3． 酶標板加上蓋，37℃反應90分鐘。

4． 反應后用自動洗板機吸去酶標板內的液體；或甩去酶標板內液體，再對著吸水紙拍幾下。洗滌2次。

5． 將準備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應60分鐘。

6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。

7． 將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應30分鐘。

8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。

9． 按每孔0.1ml依次加入TMB顯色工作液，37℃避光反應，反應過程中，要經常的觀察，當肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯時，即可加入TMB終止液0.1ml/孔。（顯色反應zui長不要超過30分鐘）。

10． 用酶標儀在450nm測定O.D.值。

11． 根據樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了N倍，其實際濃度應該×N。