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恒遠文獻：丹參注射液預防大鼠急性胰腺炎及其機制研究
閱讀：413 發布時間：2019-12-20丹參注射液預防大鼠急性胰腺炎及其機制研究
鄭俊全
內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010050
摘 要：目的 觀察丹參注射液預防大鼠急性胰腺炎及其對血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL-6）、胰腺組織核因子（NF-κB）及氧自由基的影響。方法 將 60 只 SD 大鼠隨機分為 6 組，分別為假手術組、模型組、烏司他丁組（20 000U/kg）以及丹參注射液低、中、高劑量（0.4、0.8、1.6 mL/kg）組。用 5%牛磺膽酸鈉（1.0 mL/kg）胰管內注入誘導大鼠急性胰腺炎模型，造模前 30 min 分別尾 iv 給予丹參注射液。各組大鼠均于造模 6 h 后行腹主動脈采血，處死大鼠取胰腺組織標本，檢測 SD 大鼠急性胰腺炎模型血清淀粉酶（AMY）、血漿內毒素（ET）、胰腺病理評分和病死率。并用 ELISA 法檢測血清 IL-6、TNF-α 濃度的變化，運用免疫組化法檢測 NF-κ B 表達水平，同時切取各時間點大鼠胰腺組織，檢測丙二醛（MDA）、組織髓過氧化物酶（MPO）及超氧化物歧化酶（SOD）的水平。結果 模型組大鼠的血清 AMY、血漿 ET、病理評分、死亡率、IL-6、TNF-α 水平及胰腺組織中 NF-κB 活性、MDA 水平和 MPO 活性均較假手術組升高（P＜0.01），而 SOD 活性則明顯降低（P＜0.05）；烏司他丁組和丹參注射液組上述各項指標均較模型組明顯改善（P＜0.05、0.01）。結論 丹參注射液可顯著降低實驗性急性胰腺炎大鼠的 IL-6、TNF-α 及 NF-κB，清除氧自由基，減輕脂質過氧化反應，從而減輕急性胰腺炎病理損害程度，降低急性胰腺炎大鼠的死亡率。
關鍵詞：丹參注射液；急性胰腺炎；大鼠；IL-6；TNF-α；NF-κB；氧化應激
急性胰腺炎是胰腺的急性炎癥，輕癥急性胰腺炎為自限性，無明顯的器官功能障礙；重癥急性胰腺炎則有胰腺壞死、出血，炎癥可波及胰周組織，甚至累及遠處器官．可出現局部并發癥，如胰腺壞死、胰腺假性囊腫、胰腺膿腫等，亦可并發多器官功能衰竭，死亡率 10%～20%[1]。丹參注射液的主要組分為丹參，具有活血化瘀的功能，主治瘀血閉阻所致的胸痹，癥見胸部疼痛、病處固定，或冠心病、心絞痛見上述證候者[2-3]。研究表明，丹參注射液能夠顯著降低急性胰腺炎患者的血黏度，改善胰腺的微循環障礙，減輕胰腺病變，被推薦為臨床上治療急性胰腺炎的常用輔助治療藥物，能夠有效降低病死率，減少并發癥[4]。本實驗考察丹參注射液對急性胰腺炎大鼠血清淀粉酶、血漿內毒素、胰腺病理評分和病死率的影響，判斷丹參注射液是否具有改善胰腺病理損害的治療作用。同時測定血清IL-6、TNF-α、NF-κB 活性及氧自由基，探討丹注射液對急性胰腺炎的作用機制。
1 材料和方法
1.1 實驗動物和分組
清潔級雄性 SD 大鼠 50 只，體質量（280±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，合格證號
SCXK（滬）2007-0005。SD 大鼠隨機分為 6 組，每組 10 只，分別為假手術組、模型組、烏司他丁組（20 000 U/kg）以及丹參注射液低、中、高劑量（0.4、0.8、1.6mL/kg）組。在 22 ℃恒溫房內飼養，標準顆粒混合飼料喂飼。
1.2 藥物與試劑
牛磺膽酸鈉（美國 Sigma 公司，批號 TO875，質量分數≥95%）；丹參注射液（上海第yi生化藥業
有限公司，批號 1007291，規格 2 mL/支）；IL-6、TNF-α 試劑盒（北京方程生物科技有限公司）；ET-1試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司）；淀粉酶、超氧化物歧化酶（SOD）、組織髓過氧化物酶（MPO）試劑盒和丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；NF-κB鼠單克隆抗（Santa Cruz公司）；注射用烏司他丁（廣東天普生化醫藥股份有限公司，批號 20120119，規格 100 000 U/支）。
1.3 方法
1.3.1 急性胰腺炎動物模型的建立 參照 Aho[5]的方法。SD 大鼠術前禁食 12 h 以上，不禁水，采用ip 10%水合氯醛溶液麻醉，劑量為 4.0 mL/kg，大鼠取仰臥位，四肢及頭部無創固定于手術臺上，去毛
備皮，消毒，鋪無菌巾。正中切口進腹，切口長約2.0 cm，沿幽門尋及十二指腸，定位胰膽管十二指
腸開口，于胰膽管開口附近十二指腸壁上用 4 號頭皮靜脈針穿刺進入腸腔內，再穿入胰膽管內，用膽
管脈夾夾閉膽胰管近肝門端，緩慢注入 5%牛磺膽酸鈉（1.0 mL/kg），保持壓力 5 min 后拔去膽管、
退出穿刺針，縫合十二指腸，逐層關腹。
1.3.2 給藥 丹參注射液組在造模前 30 min 分別尾 iv 給予丹參注射液 0.4、0.8、1.6 mL/kg，模型組在造模前尾 iv 給予 1.5 mL/kg 生理鹽水，假手術組尾 iv 給予 1.5 mL/kg 生理鹽水，進腹后不插管，僅顯露、牽拉胰腺即關腹。烏司他丁組于造模后即刻ip 注射用烏司他丁 20 000 U/kg。造模后 6 h 后行主動脈采血，處死大鼠，并剖腹快速取胰腺組織標本，待測。
1.3.3 標本采集 各組大鼠均于造模 6 h 后行腹主動脈采血 2 mL，所采血標本 37 ℃靜置 20 min，隨
即 4 ℃、3 000 r/min 離心 15 min，分離血清，移取血清于 EP 管中，置于−20 ℃冰箱中凍存備用（用于血清 IL-6、TNF-α 測定）。取血 2 mL，迅速注入冷卻的酶抑制劑（10%EDTA·Na2 30 μL 和抑肽酶 40 μL）抗凝管中，搖勻，4 ℃、3 000 r/min 離心 10 min，分離血漿，−20 ℃保存待測（用于血漿 ET-l 測定）。處死大鼠后迅速剖腹分離胰腺，將其中一部分迅速保存于液氮罐中，然后轉移至−80 ℃冰箱中凍存，用于組織勻漿（用于胰腺組織 SOD、MDA 及MPO 測定）。將另外一部分胰腺組織用 10%福爾馬林固定，用于病理組織學分析。
1.3.4 組織病理學觀察 處死大鼠后迅速摘取每大鼠胰腺，取部分胰腺組織常規制成石蠟切片，HE染色，由病理科醫生對大鼠胰腺組織切片，在光學顯微鏡下觀察胰腺組織病理變化，并按照 Schmidt法半定量評分標準進行組織病理學評分[6]。
1.3.5 指標檢測 采用酶法，由貝克曼庫爾特AU5800 全自動生化分析儀進行檢測。采用放射免疫法檢測血漿 ET-1，試劑盒可檢測范圍 20～−1 000pg/mL，靈敏度為 5 pg/mL；采用 Indogen 法行 125IET-1 標記，比放射性為 1 750 Ci/mmol；取采集好的血清標本采用雙抗體央心法酶聯免疫法吸附試驗（ELISA）檢測血清 IL-6、TNF-α 含量，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，后于酶標儀 450 nm 處現代藥物與臨床 Drugs & Clinic 第 30 卷 第 1 期 2015 年 1 月 ·15·測定各孔吸光度值，重復測 3 次。通過標準曲線計算樣品中大鼠血清中 IL-6、TNF-α 濃度；取大鼠胰腺組織石蠟切片，常規脫蠟，梯度水化，然后采用鏈霉親合素–過氧化物酶（S-P）法檢測胰腺細胞NF-κB 活性；取凍存的胰腺組織用冷生理鹽水制備成 10%組織勻漿，超聲粉碎后，4 ℃下 10 000 r/min高速離心 15 min，取上清液，采用黃嘌呤氧化酶法測定 SOD、MDA。蛋白定量采用考馬斯亮藍法。MPO 活性采用比色法測定，460 nm 波長，1 cm 光徑，比色。以上操作均嚴格按照試劑盒說明書完成。
1.3.6 死亡率觀察 實驗期間觀察各組大鼠死亡情況，計算各組死亡率，進行比較。
1.3.7 統計學方法 采用 SPSS 18.0 統計軟件進行數據處理，數據以?x ± s 表示，計量資料采用 t 檢驗，計數資料采用 χ
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