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“恒遠生物”產品文獻：滋陰補陽方序貫療法對多囊卵巢綜合征
閱讀：604 發布時間：2019-4-24滋陰補陽方序貫療法對多囊卵巢綜合征（ＰＣＯＳ）大鼠卵巢顆粒細胞（ＧＣ）分泌功能和細胞因子基因表達的影響
徐括琴１，尹巧芝２，黨麗英１，侯玉華１，楊小風１
１．鄭州大學附屬鄭州中心醫院 婦產科（鄭州４５００００），２．成都中醫藥大學婦科教研室（成都６１００７５）
摘 要 目的：研究滋陰補陽方序貫療法對多囊卵巢綜合征（ＰＣＯＳ）大鼠卵巢顆粒細胞（ＧＣ）分泌功能和細胞因子基因表達產生的影響。方法：利用隨機數字表法將實驗雌性性ＳＤ 大鼠分為３ 組，包括空白對照組、滋陰組以及補陽組；選取６ 周齡同樣大鼠灌胃，調配空白血清與用藥血清；對ＰＣＯＳ大鼠 ＧＣ 及黃素化顆粒細胞進行分離培養，并以隨機方法分為１０組，比較各組細胞培養液里
面雌二醇（Ｅ２）、類胰島素增長因子（ＩＧＦ－１）、干細胞因子（ＳＣＦ）以及睪酮（Ｔ）水平，并觀察ＳＣＦ ｍＲ－ ＮＡ 表達情況。結果：模型組１ＧＣ 里面 Ｅ２ 水平明顯低于對照組（Ｐ ＜０．０５），且 ＳＣＦ 水平明顯高于
對照組；滋陰方組２ＳＣＦ 與滋陰方組３ＳＣＦ 水平均明顯低于模型組１（Ｐ ＜０．０５），而滋陰方組２Ｅ２
與滋陰方組３Ｅ２水平均明顯高于模型組１（Ｐ＜０．０５）；模型組１大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達明顯高于對照組，且ＩＧＦ－１灰度值明顯小于對照組（Ｐ＜０．０５），滋陰方組２ 與滋陰方組３ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達均顯著低于模型組１（Ｐ＜０．０５），滋陰方組３ＩＧＦ－１ 灰度值明顯高于模型組１（Ｐ ＜０．０５）；模型組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞里面Ｔ 水平明顯高于對照組（Ｐ＜０．０５）；補陽方組２與補陽方組３Ｔ水平明顯低于模型組（Ｐ＜０．０５），而補陽方組１Ｔ 水平與模型組的比較無顯著差異（Ｐ＞０．０５）；對照組、模型組、補陽方組黃素化顆粒細胞里面ＳＣＦ 水平、ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達以及ＩＧＦ－１灰度值比較無顯
著差異（Ｐ＞０．０５）。結論：對ＰＣＯＳ采取滋陰補陽方序貫療法，能提高 ＧＣ 分泌功能，同時可以降低卵泡期ＳＣＦ 基因在體內的表達實現，可為ＰＣＯＳ排卵障礙臨床治療提供依據。
主題詞 多囊卵巢綜合征／中醫藥療法 ＠滋陰補陽方 大鼠 動物，實驗
中圖分類號：Ｒ７３７．３１ 文獻標識碼：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊｉ．ｓｓｎ．１０００－７３６９．２０１７．０７．０８３
多囊卵巢綜合征（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃｏｖａｒｉａｎｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＣＯＳ）是與各器官、系統正常內分泌紊亂相關的疾病，患者臨床表現具 有多樣化特點，現今其病理機制缺乏統一結論。有報道指出， 育齡婦女群體 ＰＣＯＳ發病率高達５％ ～１０％ ，并且和７５％ 左右無排卵性不孕患者密切相關［１］。亦有研究顯示，部分卵巢局部調節因子的表達和 ＰＣＯＳ 發病存在緊密聯系［２］。干細胞因子
（Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ，ＳＣＦ）屬于卵巢局部相對重要的一種生長因子，可對細胞增殖分化產生促進作用。現階段，與 ＳＣＦ 在 Ｐ－ ＣＯＳ患者卵巢局部產生的促進作用相關研究較多，可是涉及ＳＣＦ 在 ＰＣＯＳ臨床發病機制中作用的研究卻不多。本文以大鼠實驗，探討滋陰補陽方序貫療法對 ＰＣＯＳ 大鼠卵巢顆粒細胞
（ＧＣ）分泌功能和ＳＣＦ 基因表達產生的影響，現匯報如下。
材料與方法
１ 動物 選取８４ 只雌性 ＳＤ 大鼠，每只日齡均為２１ 日，體重為４０～５０ｇ；另選取５０只雌性ＳＤ 大鼠，每只６周齡，并且體重為１７０～１８０ｇ，所有大鼠均清潔級飼養，給予自然光照，控制室溫不超過２０ ℃ ～２５ ℃范圍。
２ 藥物與主要試劑 由武漢遠城科技發展公司提供脫氫表雄酮（ＤＨＥＡ）；浙江田雨藥用油有限公司提供實驗注射大豆油；滋陰方組成成分為：紫河車、熟地黃、菟絲子、當歸、白芍以 及山茱萸等中藥；補陽方組成成分為：yin羊藿、黨參、補骨脂、巴 戟天以及川續斷等。混合以上中藥，置于水中浸泡１ｈ 后，采用武火煮沸，然后用文火煮 ２０ ｍｉｎ，將其過濾，并且重復煎 ２
次，后合并濾液，置于５５ ℃ ～６０ ℃水浴條件下濃縮。實驗給藥量依據人鼠劑量［３］進行換算，其中滋陰方含生藥量為 ２．４８ ｇ／ｋｇ，對于補陽方，則含生藥量為２．２０ｇ／ｋｇ，并將煎劑冷卻后放在４℃ 溫度下保存。
由 ＨｙＣｌｏｎｅ公司提供 ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 培養基、胰蛋白酶，由 ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ 公司提供１０％ 胎牛血清；北京賽百盛生物工程公司提供ＳＣＦ 與 β－ａｃｔｉｎ 引物，上海恒遠生物科技有限公司提供
ＥＬＩＳＡ 試 劑 盒；Ｂｉｏ－Ｔｅｋｅ 公 司 提 供 ＲＮＡ 提 取 試 劑 盒，；
ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ，ＴａｋａＲａ公司；上海博升生物科技有限公司提供孕馬血清促性腺激素（ＰＭＳＧ），并由上海生物化學制藥廠提供人絨毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）。
３ 實驗方法
３．１ 構建實驗 ＰＣＯＳ 大鼠模型：對８４ 只雌性 ＳＤ 大鼠進行編號，將其隨機分成模型組（ｎ＝６７）與空白對照組（ｎ＝１７）。 ８４只大鼠全部在２１ｄ 齡斷乳，實驗開始第１ 天為適應性喂養進行２ｄ后，即在２３ｄ 齡，模型組每天需定時在其頸背部采取
皮下注射方式予以６ ｍｇ／１００ｇ 的 ＤＨＥＡ 以及０．２ ｍｌ量的注射用大豆油，并對對照組每天在頸背部采取皮下注射方式予以０．２ ｍｌ量的注射用大豆油，均持續應用１ 月。模型組大鼠在注射第２０ｄ需要每天獲取其陰道涂片，通過陰道涂片了解到大鼠正在動情間期，沒有動情周期變化以及排卵現象；２ 組均在第 ３０ｄ進行眼眶靜脈采血，其中模型組大鼠血清激素睪酮水平升高表示造模成功，本實驗有７只造模失敗必須剔除。
３．２ 分裂并且培養顆粒細胞：在第３１ 天需對每只大鼠采取頸部皮下注射方式予以 ＰＭＳＧ５０ＩＵ，并于４８ｈ 后在模型組里面以隨機原則選３０只大鼠，同時在空白對照組里面選１０ 只大鼠，將其處死之后摘取卵巢，有效分離并且培養 ＧＣ。對于模型組與對照組之中剩余大鼠，分別為３０ 只與７ 只，均以頸部皮下注射方式給予 ＨＣＧ２５ＩＵ，并在注射后第６天將其處死，然后摘取卵巢有效分離并且培養卵巢部位黃素化顆粒細胞。處于無菌條件下對所取卵巢進行分離處理，去除附近脂肪組織，放于低倍顯微鏡下采取２５ 號針頭將大鼠卵泡刺破，并且輕拍擠壓，確保卵母細胞與其顆粒細胞同時順利逸出。采用２００ 目鋼篩進行過濾，并在離心處理后收集顆粒細胞。選用０．４％ 臺盼藍進行染色計數，如果鏡下沒有染為藍色，說明是死細胞［４］。控制 ＧＣ 密度數值為１．０×１０５／ｍｌ，并且接種于底面積２５ｃｍ２培養瓶里面，其中每培養瓶體積為 １ ｍｌ，放 在 ３７℃ 且含 ５％ ＣＯ２ 相應培養箱內部恒溫培養。待大部分細胞基本貼壁之后需更換培養液，之后應該每隔４８ｈ進行１次更換。待細胞培養４８ｈ，需以０．１％ 胰酶消化，獲得單細胞懸液，采取磷酸緩沖液沖洗２次，并以４％ 多聚甲醛將其固定１０ ｍｉｎ。如果 ＨＥ染色顯示細胞形態完整，外觀為多角形，同時核呈深藍色，此外胞漿淡紅色伴隨許多顆粒，且是 ＧＣ，待其貼壁后備用［５］。
３．３ 調配含藥血清：將所選５０ 只６ 周實驗大鼠按照隨機原則分為補陽組、滋陰組以及空白對照組，采用中藥與 ０．９％ ＮａＣｌ溶液灌胃。對于灌胃給藥劑量，必須是正常大鼠劑量十倍，保證２ 次／ｄ，間隔時間為１２ｈ，控制灌胃藥總體積≤３ ｍｌ，且持續給藥３ｄ，注意第３ｄ取血樣前嚴格禁食１２ｈ，同時１ 次給予全天劑量，并于給藥１ｈ后進行麻醉處理，再行心臟采血。離心處理血樣之后，同組血清混合，然后過濾，置于５６ ℃ 溫度下滅活，放在－２０ ℃條件存儲［６］。
３．４ 分組與藥物干預：對所培養獲得的顆粒細胞進行分組，共１０組，且各組樣本包括５ 個復孔。具體干預措施為：空白對照組采用原代培養所獲得的正常大鼠 ＧＣ；模型組１ 采用模型組大鼠 ＧＣ；滋陰方組１采用含５％ 滋陰方藥相應血清*培養液，其中包含 ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％ 三抗以及１０％ＦＣＳ；滋陰方組２采用含１０％ 滋陰方藥相應血清*培養液進行研究；滋陰方組３采用含２０％ 滋陰方藥相應血清*培養液進行研究；補陽方組１采用含５％ 補陽方藥相應血清*培養液進行研究； 補陽方組２采用含１０％ 補陽方藥相應血清培養液進行研究；補
ＰＣＲ 具體反應程序完成后，利用ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＳｏｆｔｗａｒｅ軟件自動獲取 ＱＲ 值。以熒光定量 ＲＴ－ＰＣＲ 法［８］測定ＩＧＦ－１ 表達灰度值。
４ 觀察指標 觀察各組細胞培養液里面 Ｅ２ 、ＳＣＦ、Ｔ 水平、ＩＧＦ－１表達灰度值及ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達情況。
５ 統計學方法 選用ＳＰＳＳ１９．０ 統計學軟件分析觀察指
標數據，其中計量資料以珚ｘ±ｓ 表示，計數資料以（％）表示，分別用ｔ 值與 χ２ 值檢驗。結果顯示 Ｐ ＜０．０５ 表明差異有統計學意義。
結 果
１ 對照組、模型組１與滋陰方組 ＧＣ 里面 Ｅ２ 、ＳＣＦ 水平比
較 模型組１ＧＣ 里面 Ｅ２ 水平為（２４．５３±６．０２）ｐｍｏｌ／Ｌ，明顯低于對照組（３３．５４±６．０９）ｐｍｏｌ／Ｌ（Ｐ ＜０．０５），且 ＳＣＦ 水平（２７８６．
００±９４．００）ｐｇ／ｍｌ，明顯高于對照組（２５４９．００±５８．００）ｐｇ／ｍＬ；
滋陰方組２ＳＣＦ（２４８９．００±１２７．００）ｐｇ／ｍｌ與滋陰方組 ３ＳＣＦ
（２４７３．００±１０９．００）ｐｇ／ｍＬ 均明顯低于模型組１（Ｐ ＜０．０５），而滋陰方組２Ｅ２（３３．２８±３．５７）ｐｍｏｌ／Ｌ 與滋陰方組３Ｅ２ （３３．８５±
２．３０）ｐｍｏｌ／Ｌ 均明顯高于模型組１（Ｐ＜０．０５）。
２ 對照組、模型組１ 與滋陰方組大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達情況、ＩＧＦ－１灰度值比較 模型組１ 大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表
達（１．０２±０．０３）明顯高于對照組（０．１３±０．１９）（Ｐ ＜０．０５），且
ＩＧＦ－１灰度值（１５４．９３±８．１７）明顯小于對照組（１６９．２０±２．６８）；滋陰方組２ ＧＣ ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達（０．２３±０．０７）與滋陰方組 ３
ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達（０．２０±０．１４）均顯著低于模型組１（Ｐ ＜０． ０５），滋陰方組３ＩＧＦ－１灰度值（１６７．０３±４．２６）明顯高于模型組
１（Ｐ＜０．０５）。
３ 對照組、模型組與補陽方組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞里面Ｔ、ＳＣＦ 水平比較 模型組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞里面Ｔ 為（４．８９±０．４５）ｎｇ／ｍｌ，明顯高于對照組（４．１１±０．
４７）ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）；補陽方組２Ｔ（４．３５±０．２６）ｎｇ／ｍｌ與補陽方組３Ｔ（４．３２±０．２９）ｎｇ／ｍｌ明顯低于模型組（Ｐ ＜０．０５），而補陽方組１Ｔ 水平與模型組的比較無顯著差異（Ｐ ＞０．０５）；５ 組 ＳＣＦ 水平比較無顯著差異（Ｐ＞０．０５），見表１。
表１ 對照組、模型組與補陽方組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞里面Ｔ、ＳＣＦ 水平比較（珚ｘ±ｓ）
組 別 ｎ ＳＣＦ（ｐｇ／Ｌ） Ｔ（ｎｇ／ｍＬ）
陽方組
３采用含
２０％
補陽方藥相應血清培養液進行研究；空白
對照組采用原代培養所得正常大鼠卵巢部位黃素化顆粒細胞進行研究；模型組采用模型組大鼠所得卵巢部位黃素化顆粒細胞進行研究。
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