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恒遠介紹采用酶聯(lián)免疫法判別鑒定抗原結(jié)合性抗體
閱讀：1529 發(fā)布時間：2014-3-27 我公司本月的五周年*活動即將結(jié)束啦，要說時間真是太快了，我公司成立的這五年來，酶聯(lián)免疫試劑盒已經(jīng)得到了多大科研機構(gòu)的認可，同時也非常感謝支持，今天恒遠介紹采用酶聯(lián)免疫法判別鑒定抗原結(jié)合性抗體。
當(dāng)用純化抗原進行選擇時，評價所選擇抗體的*方法是在高通量滴定模式下進行酶聯(lián)免疫吸附試驗。雖然這也許與抗體zui終使用無關(guān)，但它提供了一個起始的篩選實驗方案，能夠讓續(xù)后的分析集中在有希望的抗體上。大多數(shù)噬菌粒展示載體的設(shè)計容許進行兩種ELISA模式：一種是噬菌體ELISA，即用標(biāo)記的抗噬菌體二抗試劑檢測已結(jié)合的噬菌體。
另一種是可溶性scFv ELISA，即借助附在N端或C端上的表位標(biāo)簽來檢測可溶性scFv。在這兩種情況下，抗體表達都由lacZ啟動子驅(qū)動。噬菌體展示取決于缺失葡萄糖時的滲漏表達，同時為了誘導(dǎo)可溶性抗體片段的表達，也需要使用IPTG。
曾用來進行檢測的標(biāo)簽包括：9E10、SV5以及FLAG。總體上，盡管我們也發(fā)現(xiàn)一些抗體在噬菌體模式可以有信號，而在可溶性模式下卻消失，但兩種ELISA模式的結(jié)果是類似的。這也許是抗體發(fā)生了框移所致。當(dāng)這些抗體展示在噬菌體表面時，會有大量的scFv被檢測到；而當(dāng)表達為可溶性scFv時則不行。這種情況正如前面在肽文庫所描述的那樣。大多數(shù)目前所使用的噬菌粒載體都容許從噬菌體結(jié)合性scFv簡單切換到可溶性scFv。這要通過包括1個位于scFv基因和gⅢ之間的可抑制性琥珀密碼子(TAG)來實現(xiàn)。在一個非抑制株中，琥珀密碼子被讀作為終止子，因此，只有可溶性scFv。在一個非抑制株中，TAG密碼子讀作谷氨酰胺以及終止密碼子，可溶性scFv和scFv—pⅢ融合蛋白都將。也許理想的情況是，通過感染抑制株進行由噬菌體結(jié)合性scFv到可溶性scFv的轉(zhuǎn)換，但實際上這并不必要。可溶性scFv的表達在抑制株內(nèi)是很容易完成的，因此，抑制通常不過50％。粗制噬菌體或scFv樣品就可適合于大多數(shù)的預(yù)分析試驗。然而，如能簡單地進行抗體純化對于后續(xù)分析是有利的。是用包含六組氨酸標(biāo)簽的噬菌體載體，或者是將scFv基因亞克隆到一個將六組氨酸標(biāo)簽融合到scFvC末端的載體中。
不同輪次選擇中，陽性克隆的比例將取決于抗體文庫質(zhì)量、抗原性質(zhì)和物理選擇過程，包括抗原密度、是否用可溶性或固相抗原以及洗滌嚴(yán)謹(jǐn)性。我們發(fā)現(xiàn)：按照免疫管選擇程序，在第二輪后一般有10％～100％的克隆是陽性的。盡早評估多樣性，因為隨著選擇的進行，多樣性會降低。這樣就能提供一個更大容量的抗體文庫，便于從中選擇合適的抗體。
盡管結(jié)合性篩選方法是有用的，但這些常不將此法用于zui終的抗體選擇。能夠相對快速地大量抗體，可以容許建立一些除結(jié)合性方法之外的篩選方法。用于細胞內(nèi)化、受體活化、配體拮抗、病毒滅活、誘導(dǎo)或抑制凋亡的各種選擇方法，均可預(yù)期。而且，在某些情況下，例如內(nèi)化，甚或可能直接選擇具備這些功能的抗體。
采用ELISA時，噬菌體抗體可以在96孔微量滴定板中制備。將單個克隆挑人板孔中、培養(yǎng)并作為噬菌粒用輔助噬菌體進行救援。在微量板模式下噬菌體的生產(chǎn)效率不及更大體積的培養(yǎng)。這是因為不同克隆的生長率差異過大，結(jié)果有些克隆感染輔助噬菌體是在*OD值時，而其他克隆卻是在OD值過高或過低時感染。這就導(dǎo)致了不同孔中噬菌體滴度差異很大。
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