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細胞組織塊培養法
閱讀：2640 發布時間：2019-11-18一、目的
學習原代培養方法，從供體取得組織細胞后在體外進行的培養。
二、概述
組織塊培養法是常用的、簡便易行和成功率較高的原代培養方法。可以采用剪切法，即將組織塊剪切成小塊后，接種于培養瓶，組織小塊貼壁24h或更長時間后，細胞就從組織四周游出。但由于在反復剪切和接種過程中對組織塊的損傷，并不是每個小塊都能長出細胞。用于組織塊培養的培養瓶可根據不同細胞生長的需要作適當處理，如預先涂以膠原薄層，以利于上皮樣細胞等的生長。（本節以新生牛主動脈平滑肌培養為例）
三、材料
（一）儀器
1.凈化工作臺
2.恒溫水浴箱
3.冰箱（4℃、-20℃）
4.倒置相差顯微鏡
5.培養箱
（二）玻璃器皿
1.培養皿（Φ100mm）
2.吸管（彎頭）
3.燒杯（500ml、200ml、10ml）
4.廣口試劑瓶（500ml）
5.玻璃瓶（250ml、100ml）
6.培養瓶
7.廢液缸
（三）塑料器皿
1.吸頭
2.槍頭
3.膠塞
4.EP管
（四）其他物品
1.微量加樣槍
2.眼科組織剪（直尖、彎）
3.眼科組織鑷（直、彎）
4.12.5cm組織鑷（無鉤、1×2鉤）
5.25cm敷料鑷（無鉤）
6.止血鉗（18cm直紋式、12.5cm直紋式、彎紋式）
7.解剖剪
（五）試劑
1.D-Hanks液
2.小牛血清
3.RPMI1640
4.雙抗（青霉素、鏈霉素）
5.1N HCl
6. 7.4%NaHCO3
四、操作步驟
1.取材：打開胸腔，無菌操作下取出主動脈胸段，浸到預先配制好的含雙抗（500u/ml青、鏈酶素）的D-Hanks液中漂洗。
2.組織的沖洗、修剪：取出主動脈，用鋒利的剪刀修剪除去周圍組織，再用D-Hanks沖洗主動脈3次，除去血kuai及雜組織等。
3.平滑肌組織分離：縱向剖開主動脈，撕下主動脈內層，取主動脈中層的平滑肌組織，無血清RPMI1640漂洗3次。
4.剪切：將平滑肌組織用鋒利的眼科剪反復剪切至剪成1mm3小塊，在剪切過程中，可以適當向組織中滴加1～2滴培養液，以保持濕潤。
5.貼塊：將剪切好的組織小塊，用眼科鑷送入培養瓶內，用彎頭吸管將組織塊均勻擺置，每小塊間距0.5cm左右，組織塊放置好后，輕輕將培養瓶翻轉，讓瓶底朝上，向瓶內注入適量含10%牛血清培養液，蓋好瓶蓋。
6.培養：將培養瓶瓶底朝上，37℃培養箱放置2～4h，待組織小塊貼附后，將培養瓶慢慢翻轉平放，靜置培養。
7.換液：原代培養3～5d，需換液一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細胞。
組織塊培養法也可不用翻轉法，即在擺放組織塊后，向培養瓶內僅加入少量培養液，以能保持組織塊濕潤即可，蓋好瓶蓋，放置37℃培養箱24h再補加培養液。
注意事項
1.取材的組織盡快培養。因故不能即時培養，可將組織浸泡于培養液內，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果組織塊很大，應切成1cm3以下的小塊再低溫保存，但時間不能超過24h。
2.從消化道、周圍有壞死組織等污染因素存在的區域取材，可用含500～1000u/ml的青、鏈霉素BSS液漂洗5～10min，或用10%達克寧注射液沖洗浸泡10min再作培養。
3.組織塊不易貼壁，可預先在瓶壁涂薄層血清、胎汁或鼠尾膠等。
4.原代培養的1～2d內要特別注意觀察是否有細菌、霉菌的污染，一旦發現，要及時清除。